實時熒光定量PCR技術在嬰兒HIV感染早期診斷中的應用

楊朝軍，董莉娟，陳會超，戴 潔，楊 敏，金曉媚，楊 莉，陳 敏

（云南省疾病預防控制中心性病艾滋病防制所，云南 昆明 650022）

感染HIV的母親在妊娠、分娩或哺乳期間將HIV傳給嬰兒稱為垂直傳播或母嬰傳播。據世界衛生組織報告，如果不采取任何干預措施，艾滋病病毒的母嬰傳染率在15%～45%之間。如果在妊娠和哺乳期間盡早向母親和嬰兒提供抗逆轉錄病毒藥物，就可以降低直至消除母嬰傳播風險。被感染的嬰兒越早進入治療，他的生存質量越好。常用的嬰兒早期診斷方法為HIV核酸檢測，而核酸的聚合酶鏈式反應（PCR）技術發展很快，目前，廣泛應用的是實時熒光定量PCR技術（Real-time PCR，qPCR）。為此，作者對該技術在嬰兒早期診斷上的應用開展了研究。

1 對象與方法

1.1 對象 調查對象為大理州和德宏州的感染艾滋病病毒的產婦所生的嬰兒。各級婦幼保健機構負責收集相關信息，產婦需要簽署知情同意書，嬰兒在出生后1天、7天、21天、42天和3個月分別由醫務人員采血制備干血斑樣品，通過快遞寄到云南省疾病預防控制中心進行檢測。

1.2 方法 ① 從干血斑樣品（DBS）中提取細胞基因組DNA。試劑為德國QIAamp DNA Mini Kit，操作步驟如下：打孔器打下3個直徑為6mm的干血斑，加入ATL緩沖液180μL，85℃水浴10 min；加入蛋白酶K 20μL，56℃水浴1小時；加入AL緩沖液210μL，70℃水浴10 min；加入無水乙醇200μL，混勻后轉移至分離柱，6000g 離心1 min；加入AW1洗液500μL，6000g 離心1 min；加入AW2洗液500μL，30000g 離心3 min；最后，加入洗脫液AE 50μL，6000g 離心1 min，得到核酸樣品。② 核酸樣品的擴增和檢測。試劑為廣州海力特生物科技有限公司的人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）DNA定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。操作方法嚴格按照試劑說明書執行，使用Applied BiosystemsTM7500 實時熒光定量 PCR 系統進行擴增和分析。③ 嬰兒滿42天的干血斑用羅氏 Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan 系統進行HIV-1 核酸定性檢測。比較兩種檢測方法的準確性。

2 結果

2.1 HIV-1 DNA定量檢測 2019年4月至2020年8月共對51例嬰兒進行了采樣，其中3例嬰兒僅完成出生時的采樣，3例嬰兒完成3次采樣，2例嬰兒完成4次采樣，43例嬰兒完成5次采樣。共獲得235份干血斑樣品，采集情況見表1。經HIV-1 DNA定量檢測，檢測結果低于檢測限。

表1 51例送檢嬰兒的干血斑采集情況統計

2.2 HIV-1 DNA定性檢測 45例嬰兒完成出生后42天干血斑的采集，用羅氏 Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan 系統進行HIV-1 DNA定性檢測，檢測結果低于檢測限。

2.3 用本實驗室2012年采集的21例感染HIV的嬰兒的干血斑樣品進行熒光定量PCR檢測，嬰兒的采血時間為出生后1個月至15個月不等［1］，結果全部為HIV-1DNA 陽性，循環閾值（Cycle threshold，Ct）在14和23之 間，DNA的 平 均 值 為4428 copies/1×106cells（41-31157），詳見表2。

表2 21例感染嬰兒的熒光定量PCR檢測結果

2.4 實時熒光定量PCR技術對干血斑的檢測結果 對51例送檢嬰兒的干血斑共235個樣品進行實時熒光定量PCR檢測，結果均低于試劑盒最低檢測限；對21例已知感染嬰兒的干血斑檢測結果全部為陽性，該方法的敏感性和特異性均為100%。

3 討論

由于暴露嬰兒體內會攜帶來自母親的HIV抗體，該抗體最長在嬰兒滿18個月才會消失，所以，抗體檢測被各種早期診斷策略所替代。嬰兒早期診斷（Early infant diagnosis，EID）采用核酸檢測的方法，《全國艾滋病檢測技術規范》（2015年修訂版）要求在嬰兒出生后6周及3個月進行核酸檢測［2］。隨著相關研究的進展，發現及早治療可以減小病毒庫，因此在嬰兒早期診斷方面也在積極探索出生后及時進行核酸檢測，出生時核酸檢測結果為陰性就可以排除宮內感染。如果發生產時感染，需要在6周齡時再做核酸檢測［3］。本研究嘗試了在出生時和出生后7天和21天就進行采樣檢測，并使用高靈敏度的實時熒光PCR技術進行DNA定量檢測，探索提早檢測的方法和策略。由于在研究期間，項目地區未發生母嬰傳播的個案，所有研究對象均檢測為陰性，并且與42天的定性檢測結果相一致，因此，新技術的應用可以更早地排除感染，包括喂養過程中的感染。根據相關研究的進展，《全國艾滋病檢測技術規范》（2020年修訂版）也將首次采血的時間提早到出生后48小時內。如果核酸檢測陽性，盡快再次進行檢測，兩次檢測均陽性，就可以報告HIV核酸陽性。

嬰兒早期診斷使用的是干血斑樣本，該樣本沒有傳染性，可以室溫保存和運輸，便于傳遞到區域中心實驗室開展核酸檢測。本研究先提取HIV-1DNA，再進行實時熒光定量PCR檢測，檢測下限為20 copies/1×106cells。以羅氏人類免疫缺陷病毒（1型）核酸檢測試劑（羅氏V2.0）的結果為參考標準［4］，廣州海力特人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）DNA定量檢測試劑的特異性為100%（235/235）；以嬰兒滿18個月HIV抗體的檢測結果為標準，廣州海力特試劑的敏感性為100%（21/21）。

實時熒光定量PCR技術檢測暴露嬰兒的干血斑樣本，具有較高的敏感性和特異性，在嬰兒早期診斷領域具有發展潛力［5］，為我國實施暴露嬰兒早期診斷的策略提供了一項技術性的支持。