皮膚鱗狀細胞癌的腫瘤干細胞研究進展

孫忠輝， 張國龍， 王秀麗

（1.上海市奉賢區皮膚病防治所，上海 201408；2. 同濟大學醫學院光醫學研究所/上海市皮膚病醫院，上海 200443）

皮膚鱗狀細胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）屬最常見的皮膚惡性腫瘤之一，好發年齡50～60歲，可發生于體表的任何部位，常在癌前病變光線性角化病的基礎上發生。cSCC起源于表皮或毛囊附屬器角質形成細胞。眾多惡性腫瘤中存在腫瘤干細胞（Cancer stem cells，CSCs），已被得到證實。惡性腫瘤的進展、轉移、耐藥和復發，CSCs對其都有影響，當前針對 CSCs的靶向治療已成為一種有前途的惡性腫瘤干預策略。用于cSCC靶向治療的臨床藥物還不多，對CSCs的研究有助于這些藥物的開發。cSCC腫瘤干細胞與表皮干細胞（Epidermal stem cells，ESCs）有一定的相似性，發現兩者的差異性標記物，從而進一步明確兩者信號通路的差別，可以為開發靶向藥物奠定基礎。本文綜述目前cSCC中腫瘤干細胞的起源、特性和其標記物的研究進展。

1 皮膚鱗狀細胞癌中腫瘤干細胞的起源

干細胞能在一定條件下無限自我更新與分化增殖，產生表型與基因型和其同樣的子代細胞，其具有多向分化潛能。目前證實在皮膚中干細胞有表皮干細胞、黑色素干細胞、真皮間充質多能干細胞、內皮干細胞和造血干細胞等5 種成體干細胞。這些細胞可產生相應細胞譜系，最終發育并形成完整的皮膚。ESCs又稱上皮干細胞，是一種成體組織干細胞，包括毛囊間表皮（Interfollicular epidermis，IFE）、皮脂腺基底（Base of the sebaceous gland，BSG）和毛囊膨突部（Bulge of hair follicles，文獻習慣用毛囊干細胞HFs簡寫）干細胞，它們具有祖細胞作用，有自我更新能力和高度增殖能力。毛囊膨突部細胞是多能干細胞，通常其產生毛囊，但在皮膚損傷時可分化再生為表皮和皮脂腺細胞［1］。

腫瘤組織內很大部分是只有增殖能力的腫瘤細胞，而腫瘤干細胞雖然僅一小部分，但能形成新的腫瘤克隆。它是慢細胞周期和永生化的起源驅動細胞，具有自我更新和分化能力。惡性腫瘤的轉移和復發往往是由于CSCs沒有被完全消滅［2］。腫瘤細胞通常是正常細胞經歷4 ～7 次突變后形成。占表皮大多數的角質形成細胞如持續暴露在紫外線（Ultraviolet，UV ）、化學致癌物和人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染等環境中，獲得致癌突變的能力會增高。在表皮，大多數獲得突變的細胞都是在正常分化過程的終末中出現，而腫瘤的發展通常需要不止一次突變，因而皮膚腫瘤的發生相對較少。CSCs和正常干細胞具有部分相似的生物學特性。皮膚表皮中的CSCs來源于表皮干細胞（Epidermal stem cells，ESCs）［1］，ESCs也需要經歷突變才能成為CSCs。ESCs具有形成腫瘤的能力，但是在致突變后克隆擴增的驅動因素出現前，它們盡管可能攜帶這些突變卻在表型上一直是正常的。相較正常表皮干細胞，此階段的ESCs及其子代具有明顯異質性，它們具有更長的細胞周期，更強的修復能力，但是顯然它們的癌變趨勢明顯增強［3］。

現有研究［4］證實，cSCC的起源細胞為表皮干細胞。二甲苯蒽（DMBA）/ 十四烷醋酸佛波醇（TPA）是一種常用的致cSCC的物質。研究［5］發現在DMBA治療1年后給予TPA的小鼠與在DMBA治療后立即暴露于TPA的小鼠相似，都會發生癌癥；無論何時給予TPA，腫瘤潛伏期都非常短。該研究表明cSCC中DMBA誘導的腫瘤干細胞是長壽命、慢循環的細胞，cSCC起源于表皮干細胞（ESCs），也就是毛囊間表皮干細胞（IFE）和毛囊膨突部細胞（HFs），因此cSCC中的CSCs也被認為起源于ESCs。然而僅獲得干細胞特征還不足以導致這些ESCs惡性轉化，研究表明特定類型或部位的細胞發生突變更為重要［5］。例如，HFs干細胞中如出現Harvey-Ras（H-Ras）表達通常具有高惡變能力，但當這種突變在IFE表皮干細胞中出現時，病變很少是惡性的，只有良性腫瘤生長（乳頭狀瘤形式）。這表明IFE起源的惡性腫瘤生長與其他促進因素的持續影響有關，而與H-Ras是否激活無關。cSCC長期以來被認為只是起源于HFs，但目前研究證明CSCs也可以來自IFE。維持完整的HFs 表皮干細胞，同時去除IFE 表皮干細胞，形成良性瘤和cSCC的能力都會降低。HFs突變成cSCC的能力降低表明cSCC起源細胞不僅來自HFs，也存在于IFE中［1］。

2 皮膚鱗狀細胞癌中腫瘤干細胞的可塑性和異質性

CSCs的可塑性（Plasticity）是指其具有轉變為多種不同類型細胞的能力，而異質性（Heterogeneity）是指其子代與親代及不同子代之間，表型或基因型方面的差異性。由于大多數惡性腫瘤含有以上特征的CSCs，因而這些腫瘤的發生、發展、轉移和復發機制非常復雜，同時也造成了治療的難度。

正常干細胞（SCs）定植在專門的微環境中，即所謂的壁龕（Niche）。外部信號可以調節干細胞狀態及其后代的生物特性。在cSCC，皮膚由于長期暴露于紫外線、化學物或者HPV感染，在特定的調節信號表達或癌基因的激活參與下，SCs可轉化為CSCs［6］。這種可塑性變化與微環境中上皮間質轉化（EMT）密切相關。例如，毛囊膨突部干細胞（HFs）可以在Kras G12D表達和腫瘤抑制因子Tp53功能喪失時充當cSCC的起源腫瘤細胞。而環氧合酶-2（Cox-2）可以調節上皮間充質轉變，能介導間充質樣梭形細胞cSCC（預后較差的cSCC，鱗狀細胞分化特征基本喪失）的形成。學者研究［7］利用工具鼠krt 15-crePR+ 在HFs中使癌基因Ras/Tp53相應表達誘導產生具有間充質特征的cSCC形成，然后下調并抑制Cox-2的功能，結果顯示HFs來源的腫瘤間充質轉化特征明顯減少，而且腫瘤逐漸轉化為具有上皮特征，向良性轉化。

間充質細胞表型的獲得使惡性腫瘤細胞容易侵襲和轉移。EMT激活的過程涉及到一定的細胞因子和信號分子［8］。目前認為，轉化生長因子β（TGF-β）是最重要的因子之一。cSCC侵襲進展過程中，CSCs能與腫瘤微環境相互作用。TGF-β上調引起CSCs釋放IL-33作為信號，促進微環境募集ST2+造血祖細胞分化為FcεRIα+的巨噬細胞。FcεRIα+巨噬細胞又會釋放TGF-β，由此產生富含TGF-β的微環境，激活TGF-β信號，進一步釋放CSCs相關功能，如NRF2介導的抗氧化反應［9］，促進cSCC發展。

腫瘤都存在異質性，CSCs導致cSCC中的異質性與所涉及的特定癌基因有關。過渡擴充細胞（Transit-amplifying cell，TACs）是一種中間體，其介于干細胞和完全分化細胞之間。正常情況下，具有譜系限制性的TACs子代缺乏產生腫瘤，甚至良性乳頭狀瘤的能力。HFs中，對KrasG12D突變的反應是角質形成細胞過度增殖和去分化（乳頭狀瘤形式）。有研究表明盡管上游信號通路MAPK和AKT-S6表達均增加，但攜帶KrasG12D的TACs細胞表型依然能保持正常［10］。TACs細胞無異常表型可能是由于突變癌基因表達不足，從而未能啟動腫瘤發生。另一項研究中，同樣攜帶krasG12D 的HFs，在缺乏腫瘤抑制基因TP53的保護下，可發生cSCC。而且TP53如出現R172H突變和基因拷貝數改變會預后更差［11］。這些結果表明，特定癌基因或抑癌基因的激活和抑制決定了腫瘤的發生，并且可以出現在祖細胞、終末分化干細胞或低分化的TACs細胞中。因此，臨床cSCC中腫瘤的不同分化狀態可能與CSCs被特定基因如何激活有關。

原發的表皮腫瘤都起源于CSCs，然而特定基因突變的發生在不同情況下又可產生不同的腫瘤表型。角蛋白15（K15）是毛囊膨突干細胞的標志物。利用其 K15+小鼠模型，Kras的G12D突變可引發良性乳頭狀瘤，但再在DMBA誘導下可引發cSCC［12］。KrasG12D突變合并Smad4缺失不僅可以導致該模型鼠的轉移性cSCC，而且還產生其他腫瘤，如基底細胞癌、毛發上皮瘤和皮脂腺瘤［13］。基底細胞癌和cSCC的CSCs都起源于表皮IFE和HFs，它們不同表型的引起顯然與某些特定基因差異表達有關。近期有研究［14］表明基底細胞癌特異性基因（如GLI2、PTCH1/ 2、FZD7），在基底細胞癌細胞中高表達，但在cSCC中卻下調。顯然以上基因的表達在cSCC是抑癌因素，在基底細胞癌細胞中則是促癌因素。

3 皮膚鱗狀細胞癌中腫瘤干細胞標志物及調控因子

目前，皮膚干細胞標記物包括CD34、CD44、ABC家族成員、CDl33、整合素、P63、CD20、角蛋白15、角蛋白17和角蛋白19等。cSCC中皮膚CSCs與皮膚干細胞有一定的相似性，以上標記物部分已被證實與皮膚鱗癌有關，比如CDl33［15］。但兩者之間有何明確的區別目前還不清楚，需要進一步研究發現兩者的差異性標記。明確兩者信號通路的差異，選擇性殺傷皮膚腫瘤干細胞，避免損傷皮膚干細胞，對腫瘤的治療尤為重要［16］。

近期，在研究cSCC時發現腫瘤干細胞中一些與分類和發病有關的標志物，這些標志物備受人們的關注。①CD133 ： cSCC腫瘤干細胞的表面標記物中最早可以作為分類標志。Patel等［15］研究癌癥起始細胞（CIC）向皮膚腫瘤干細胞（CSC）轉化時，首先采用基于CD133是否表達的cSCC細胞系簡單分類，證明在異種移植模型中CD133陽性的CICs中含有異質性cSCC，而CD133陰性細胞不能維持cSCC繼續發展［18］。除了細胞表面標記物，cSCC腫瘤干細胞還可以根據醛脫氫酶（ALDH）和ABC轉運蛋白活性進行分類。②Survivin： Lotti等［17］最早提出表皮干細胞是皮膚腫瘤起源細胞。他們研究了皮膚干細胞的標志物Survivin在cSCC展中的作用。siRNA敲除Survivin后減少了細胞克隆形成和細胞存活率，侵襲性降低。正常角質形成細胞轉染致癌RAS逆轉錄 Q病毒和加入NF-κB抑制劑IκBαM可促進Survivin的表達。但是這些細胞中敲除Survivin雖然可以減少增殖，但不能阻止異種移植模型中腫瘤的形成，只會延緩它們的發展。③SOX2 ： Siegle等［18］比較了小鼠cSCC的癌癥起始細胞（Cancer initiating cells，CIC）、HFs干細胞和表皮祖細胞中的基因表達譜，發現它們表達最顯著的是SOX2。通過免疫染色，證實SOX2在正常皮膚樣本中缺失，只在cSCC中存在。SOX2在腫瘤/間質交界處的未分化細胞中表達，這些細胞來源于CSC微環境。SOX2基因敲除顯示腫瘤生長減少，表明SOX2在cSCC的發展中起促癌作用。研究還顯示SOX2從AK到cSCC譜系發展中表達均增加。④FRMD4A：有學者在鑒定IFE表皮干細胞時，發現FRMD4A是一個新的腫瘤干細胞標志物［19］。通過Q-PCR對cSCC細胞上的14個表皮干細胞標記物進行檢測，證實FRMD4A是唯一一個在cSCC中持續上調明顯的基因［20］。它的表達為探索正常干細胞和腫瘤干細胞標記物之間的關系提供了一種手段。FRMD4A可調節細胞間粘附并維持正常細胞中E-鈣粘蛋白（E-cad）的表達；在體外和體內的異種移植模型中，人cSCC細胞系中FRMD4A的敲除降低了腫瘤細胞的克隆形成效率和生長潛力。從機制上講，FRMD4A的表達降低調節了Hippo通路，該通路與組織生長和癌癥發展控制有關［21］。⑤Lrig1： 它是IFE表皮內的干細胞標志物和EGFR的拮抗劑。在cSCC中，Lrig1陽性干細胞群中炎癥可以引起癌變。炎癥因子IL-17R能夠動員Lrig1陽性的干細胞增多從而影響傷口愈合和腫瘤發生。IL-17R可以影響EGFR通路，Lrig1能夠起到腫瘤抑制因子作用［22］。⑥Lgr5是Wnt靶基因，腸上皮和毛囊的干細胞標記物。在小鼠模型可發現在毛囊干細胞“壁龕”中的慢循環細胞中表達。移植和譜系追蹤實驗表明，這些lgr5陽性細胞在很長一段時間內保持了毛囊的所有標志物，并可以構建整個新的毛囊。最近，已有研究表明Lgr5在cSCC中表達上調，可作為腫瘤干細胞標記物［23］。

以上是目前明確的皮膚干細胞標志物，也是腫瘤干細胞的標志物。它們的陽性表達可以區分出腫瘤干細胞。但它們并不精確，例如，CD133陽性細胞并不都是腫瘤干細胞，在非干細胞/祖細胞和非癌細胞中也可以檢測到ALDH活性增加。

另外，調控皮膚 cSCC 中腫瘤干細胞生長的因子還有① TGF-β可以促進cSCC化療耐藥；② BMI1：與腫瘤自我更新和腫瘤發生有關；③ YAP1是Hippo 通路的關鍵下游效應器，影響正常表皮和 cSCC 中干細胞的生長；④ Grhl3是保守的發育轉錄因子，與表皮分化、屏障形成有關，cSCC的發生起至關重要作用；⑤ TARC（CCL17）驅動Grhl3 缺失模型中腫瘤細胞過度增殖；⑥ miR-204 的缺失在曬傷中驅動 STAT3 促炎反應導致 cSCC 的發展；⑦ MEK1過度表達會促進過度增殖和皮膚炎癥，導致乳頭狀瘤形成［24］。

4 結語

cSCC具有侵襲性并可向遠處轉移，晚期、轉移性和免疫低下的患者非常適合生物治療（包括靶向和生物治療）。目前，在臨床開展成熟的主要藥物有EGFR抑制劑和免疫檢查點抑制劑，遠不能滿足精準治療的需求。幾乎所有惡性腫瘤都存在CSCs，其存在往往導致腫瘤易侵襲、易復發和治療抵抗。因此針對腫瘤干細胞治療將更加具有目的性，更加精準，臨床患者也將獲益更大。腫瘤干細胞的治療策略主要有靶向CSCs標志物、調節因子及相關異常信號通路［2］，靶抗原的特異性是成功根除CSCs和防止腫瘤復發的關鍵。盡管上文提到了多個在cSCC的CSCs標志物，但由于cSCC是一種高突變負擔的腫瘤，就目前來說，以上所及并不是非常特異。但是，隨著研究的深入，相信未來會必將出現特異、敏感的cSCC的CSCs標志物或調節因子，隨之也產生相應的藥物去治愈cSCC。