雷公藤多苷對濕疹大鼠皮損的預防作用及機制

張明昊，董文霞，薛鵬坤，高一盈，馬偉洋，王珍，馬峰偉，張圣欣，李豐

1河南中醫藥大學醫學院，鄭州450046；2河南中醫藥大學藥學院

濕疹是發生于表皮及真皮淺層的過敏性皮膚疾病，可由遺傳因素導致，也可由外部環境和生活方式引起，發病時可見皮疹對稱分布，瘙癢且有滲出傾向，易反復發作。目前臨床上治療濕疹的藥物以糖皮質激素制劑和抗組胺藥為主，用藥時間長，雖可緩解癥狀但難以有效治愈，且會存在機體抗感染能力降低、胃酸及胃蛋白酶分泌增多等不良反應，停藥后癥狀易復發[1]。中藥因其療效好、不良反應小的優勢，逐漸成為開發新型濕疹治療藥物的主要來源。雷公藤多苷是從中藥雷公藤根部提取的有效成分，具有抗腫瘤、抗炎、調節機體免疫功能等多種藥理作用[2-3]。考慮到止癢和抗炎是治療濕疹的兩個基本思路，我們將雷公藤多苷用于濕疹大鼠，觀察其對濕疹皮膚的預防效果。由于中藥具有多功效、多靶點的特點，組胺受體H1(H1R)/瞬時感受器電位受體1(TRPV1)通路、蛋白酶激活受體2(PAR-2)/TRPV1通路是皮膚濕疹癢覺發生的主要依賴途徑；絲裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)通路又與皮炎、濕疹等多種炎癥疾病的發生過程密切相關；故本研究基于H1R、PAR-2/TRPV1和p38 MAPK信號通路探討雷公藤多苷對大鼠濕疹的預防作用，旨在為雷公藤多苷治療濕疹提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SD大鼠50只，體質量180～200 g，鼠齡8周，購于鄭州市惠濟區華興實驗動物養殖場，動物生產許可證號：SCXK(豫)2019-0002。飼養于河南中醫藥大學醫學機能實驗室，飼養環境溫度為20～22 ℃，相對濕度為55%～60%，正常光照，大鼠自由飲水采食。本實驗經河南中醫藥大學動物倫理委員會審核批準。

1.1.2 藥品與試劑 雷公藤多苷片(遠大醫藥黃石飛云制藥有限公司)。2,4-二硝基氯苯(DNCB，上海麥克林生化科技有限公司)，使用前加入丙酮橄欖油配制成DNCB-丙酮橄欖油溶液。丙酮、二甲苯、甲醛、無水乙醇(煙臺市雙雙化工有限公司)，蘇木素染色液、伊紅染色液(上海尚寶生物科技有限公司)，H1R抗體、PAR-2抗體、TRPV1抗體、p38 MAPK抗體、p-p38 MAPK抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，β-actin抗體、RIPA裂解液、磷酸化蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、顯影定影試劑、ECL試劑盒、HRP標記山羊抗兔二抗(武漢塞維爾生物科技有限公司)。

1.1.3 主要儀器與設備 BS110S型電子天平(德國公司Sartorius公司)；MR-96TB型酶標儀[騁克儀器(上海)有限公司]；D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機[大龍興創實驗儀器(北京)有限公司]；CX23光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；BV-2型垂直電泳儀、BT-2型轉印電泳儀、MX-F型渦旋混合器(武漢賽維爾生物科技有限公司)；6300型化學發光儀(上海勤翔科學儀器有限公司)。

1.2 動物分組與造模 將50只大鼠隨機分為5組，分別為正常組、模型組和雷公藤多苷低、中、高劑量組，每組各10只。模型組和雷公藤多苷低、中、高劑量組采用DNCB誘導建立濕疹模型。對大鼠腹部及背部脫毛，裸露皮膚面積約為2 cm×2 cm。用微量移液器吸取80% DNCB-丙酮橄欖油溶液100 μL涂抹于腹部脫毛區致敏，1次/天，連續2 d。第6天用0.5% DNCB-丙酮橄欖油溶液100 μL涂抹于大鼠背部脫毛區進行激發；同時在大鼠右耳內外側耳面均勻涂抹1% DNCB-丙酮橄欖油溶液5 μL進行激發，1次/3天，共激發5次。

1.3 藥物干預 從實驗第3天開始，雷公藤多苷低、中、高劑量組分別給予4.5、9、18 mg/kg雷公藤多苷溶液灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續灌胃21 d。

1.4 大鼠背部皮膚外觀情況觀察 末次給藥24 h后，觀察各組大鼠背部造模區皮膚是否出現紅腫、丘疹、水皰、糜爛、滲出等濕疹表現。

1.5 大鼠耳腫脹度和耳腫脹抑制率測算 大鼠脫頸椎處死，沿耳基線剪下雙耳，用8 mm打孔器在左右耳中部同一位置打孔取圓形耳片；用電子天平精確稱重后按下列公式計算耳腫脹度和耳腫脹抑制率。耳腫脹度=右耳片質量-左耳片質量。耳腫脹抑制率(%)=(模型組耳腫脹度-藥物干預組耳腫脹度)/模型組耳腫脹度×100%。

1.6 大鼠背部皮膚組織形態學觀察 采用HE染色法。取背部造模區皮膚組織，生理鹽水沖洗后，加入4%多聚甲醛固定。經脫水、透明、包埋，切4 μm厚切片，進行HE染色，常規切片脫水、透明、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織形態學變化。

1.7 大鼠背部皮膚組織H1R、PAR-2、TRPV1蛋白表達檢測 采用免疫組織化學法。石蠟切片，脫蠟、水化，H2O2封閉，PBS清洗，檸檬酸鹽緩沖液熱修復，滴加山羊血清封閉液室溫孵育。分別滴加H1R、PAR-2、TRPV1抗體(稀釋比例1∶100)，4 ℃孵育過夜；滴加二抗(稀釋比例1∶100)37 ℃孵育20 min。DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染3 min，鹽酸乙醇分化，自來水再次沖洗，經切片脫水、透明、封片后鏡檢。每組選取5張切片，采用Image-Pro Plus6.0測定每個視野中平均光密度值，作為目標蛋白的表達量。

1.8 大鼠背部皮膚組織p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取背部造模區皮膚組織，用液氮速凍，-80 ℃儲存備用。取皮膚組織勻漿，提取總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉膜，一抗、二抗孵育，TBST漂洗，ECL試劑盒顯影成像，采用Image J軟件測定條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶的灰度值比值計算p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組背部皮膚外觀表現 正常組生存狀態良好，皮膚光滑完整，無明顯異常；模型組背部造模區皮膚出現紅腫、丘疹、水皰、糜爛和滲出等濕疹表現；雷公藤多苷低、中、高劑量組背部造模區皮膚紅腫、糜爛及滲出程度降低，丘疹和水皰出現不同程度消散，皮膚較模型組明顯光滑。

2.2 各組耳腫脹度、耳腫脹抑制率比較 與正常組比較，模型組耳腫脹度增加(P<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組耳腫脹度減少(P均<0.05)；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組耳腫脹度減少，耳腫脹抑制率增加(P均<0.05)。見表1。

表1 各組耳腫脹度和耳腫脹率比較

2.3 各組背部皮膚組織形態學比較 與正常組比較，模型組背部皮膚表皮厚度較正常組增加，角化程度升高，呈網狀并伴有海綿樣水腫，毛囊口可見角栓；真皮層中可見血管輕度擴張、充血，并伴有淋巴細胞及嗜酸性粒細胞浸潤。雷公藤多苷低、中、高劑量組背部皮膚表皮輕微增厚，可見輕微海綿樣水腫和少量淋巴細胞及嗜酸性粒細胞浸潤。

2.4 各組背部皮膚組織H1R、PAR-2、TRPV1蛋白水平比較 正常組皮膚組織中有少量H1R、PAR-2、TRPV1表達；模型組H1R、PAR-2、TRPV1表達較對照組增加(P均<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組H1R、PAR-2、TRPV1表達降低(P均<0.05)；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷高劑量組H1R、PAR-2蛋白水平升高，雷公藤多苷中劑量組TRPV1蛋白水平升高，雷公藤多苷中、高劑量組p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白水平降低(P均<0.05)。見表2。

表2 各組背部皮膚組織中H1R、PAR-2、TRPV1蛋白水平比較

2.5 各組背部皮膚組織p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達比較 與正常組比較，模型組皮膚組織中p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平升高(P均<0.05)；與模型組比較，雷公藤多苷低、中、高劑量組p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平降低(P均<0.05)；與雷公藤多苷低劑量組比較，雷公藤多苷中、高劑量組p38 MAPK、p-p38 MAPK表達水平降低(P均<0.05)。見表3。

表3 各組背部皮膚組織中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達比較

3 討論

濕疹是皮膚科常見性、多發性及難治性疾病之一，臨床以劇烈瘙癢、多樣性皮疹為主要表現，嚴重影響患者的身體健康和生活質量[4]。濕疹發病機制較為復雜，目前認為該病是由多種因子引發的表皮及真皮淺層炎癥性疾病，屬遲發性變態反應[5]。本研究采用DNCB高濃度腹部致敏，低濃度背部、耳部激發的方式構建大鼠濕疹模型，結果顯示濕疹大鼠耳腫脹度升高，背部造模區表皮增厚且過度角化，真皮層見炎癥細胞浸潤，表明造模成功。該模型背部及耳廓局部病理特征與人類濕疹相似，可用于藥物療效的評價。雷公藤為衛矛科雷公藤屬的木質藤本植物，始載于《神農本草經》，名莽草，主治頭風、癰腫、乳腫和疝瘕。雷公藤多苷是從雷公藤植物根中提取的總苷，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調節作用[6-7]，可用于自身免疫及皮炎濕疹疾病的治療，且未見明顯不良反應[8]。本研究結果顯示，雷公藤多苷能夠降低濕疹大鼠耳腫脹度，減輕背部造模區皮膚組織中海綿樣水腫及炎性細胞浸潤程度，表明雷公藤多苷具有較好的預防濕疹的作用。

皮膚瘙癢是濕疹的主要臨床表現之一，其發生主要通過組胺依賴的癢覺信號通路和非組胺依賴的PAR-2途徑共同傳遞[9]，而TRPV1是兩條信號通路共同的下游信號分子，該分子可以通過介導Ca2+的跨膜流動來影響細胞內Ca2+濃度，是癢覺通路傳遞的樞紐[10-12]。組胺依賴的癢覺信號通路由組胺激活，通過機械刺激不敏感的無髓鞘C-纖維介導，在Ca2+存在下，H1R激活磷脂酶C(PLC)和磷脂酶A2,再活化下游TRPV1通道，使Ca2+內流增加；同時PLC還可水解為二酰甘油而使TRPV1通道開放，從而誘導機體產生癢覺[13-15]。非組胺依賴的PAR-2途徑是在機械刺激熱敏感的C-纖維介導下由類胰蛋白酶激活PAR-2，活化PLC，使下游TRPV1通道開放；同時活化的PAR-2還可以激活蛋白激酶A，使TRPV1活性增加，誘導機體產生癢覺[16]。本研究結果顯示，濕疹大鼠背部皮膚組織中H1R、PAR-2、TRPV1蛋白表達水平升高，提示濕疹瘙癢的產生是H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1通路作用的結果，而雷公藤多苷可以抑制H1R、PAR-2、TRPV1蛋白表達，從而發揮抗瘙癢的作用。

p38 MAPK作為一個較為保守的絲氨酸/蘇氨酸絲裂原激活蛋白激酶，在去磷酸化狀態下無活性，只有通過磷酸化改變蛋白質構象后才能與底物和ATP結合，參與細胞衰老、細胞分化、炎癥反應等生理過程，也與皮炎、濕疹、類風濕關節炎等疾病的發生密切相關[17-19]。本研究結果顯示，濕疹大鼠背部皮膚組織p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達水平顯著升高，提示濕疹的發生與p38 MAPK磷酸化水平相關;而雷公藤多苷可以下調p38 MAPK磷酸化水平，抑制p38 MAPK信號通路激活，從而發揮抗炎作用。

綜上所述，H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1和p38 MAPK信號通路在濕疹皮膚組織中均存在異常激活現象，而雷公藤多苷可以通過下調H1R、PAR-2、TRPV1、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白水平來抑制H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1和p38 MAPK信號通路的激活，從而發揮其抗瘙癢和抗炎的作用，達到預防和減輕濕疹的目的。本研究為雷公藤多苷在濕疹治療方面的深入開發利用提供了實驗依據。