免疫調節(jié)劑在慢性乙型肝炎治療中的應用進展

奉慧東，鄭智武，陳寧

延邊大學附屬醫(yī)院感染科，吉林延吉133000

乙型肝炎病毒(HBV)感染可導致一系列肝臟和肝炎并發(fā)癥，慢性感染者中約有25%的患者最終發(fā)展為肝硬化和肝癌。干擾素α(IFN-α)和核苷(酸)類似物(NUCs)是目前治療慢性乙型肝炎(CHB)的主要藥物，通過抑制病毒復制可達到HBV的臨床治愈。但NUCs停藥后病毒復制易反彈，長期服藥不僅增加患者的經濟負擔，還會導致耐藥或腎毒性等嚴重不良反應；IFN-α可通過誘導干擾素刺激基因(ISG)直接抑制HBV DNA復制，但受到高成本、眾多不良反應和低應答率的限制。HBV感染的免疫反應涉及先天性免疫應答和適應性免疫應答。研究顯示，CHB的發(fā)展與先天性免疫應答障礙、HBV特異性免疫反應缺失有關[1]。對于CHB患者，免疫治療的目標是以恢復有效的抗病毒免疫反應的方式來調控免疫系統(tǒng)。目前有多種免疫調節(jié)劑用于治療CHB，包括維甲酸誘導基因1(RIG-1)激動劑、Toll樣受體7(TLR-7)激動劑、免疫檢查點抑制劑、治療性疫苗等。現將免疫調節(jié)劑在慢性乙型肝炎治療中的應用進展綜述如下。

1 先天性免疫調節(jié)劑

先天免疫系統(tǒng)是宿主細胞抵御病毒感染的第一道防線。模式識別受體(PRR)在感受外源病原體后，能夠快速誘導感染細胞分泌IFN，IFN誘導周圍細胞表達ISG，保護肝細胞免受新生感染[2]。然而HBV具有能夠避免先天性免疫識別的隱身特性，HBV感染并不能在黑猩猩體內誘導IFN/ISG反應，在急性HBV感染患者血清中幾乎沒有檢測到細胞因子誘導[3]。因此，針對先天性免疫反應的分子在治療CHB方面大有希望。

1.1 RIG-1激動劑 Inarigivir是一種口服HBV抗病毒藥物，是激活RIG-1、病毒感受器蛋白和核苷酸結合寡聚域的多重激動劑，具有調節(jié)宿主固有免疫和直接抑制病毒復制的作用，通過激動RIG-1受體不僅能在HBV感染細胞中誘導IFN，還可以通過識別HBV pgRNA的5＇端ε結構來阻斷HBV復制的能力[4]。

在長期感染土撥鼠肝炎病毒(WHV)的土撥鼠模型中，連續(xù)12周口服Inarigivir治療有良好的耐受性，所有土撥鼠血清WHV DNA較治療前降低，且高劑量組較低劑量組病毒載量降低更明顯；肝臟WHV核酸和抗原水平降低，肝臟炎癥減輕；停止給藥后，病毒復發(fā)有劑量依賴性延遲。這表明除了直接的抗病毒活性外，Inarigivir還可通過激活病毒感受器途徑在慢性肝炎病毒感染期間誘導抗病毒免疫[5]。

目前Inarigivir已經進行Ⅱ期臨床試驗，在未接受過治療的CHB患者中，與安慰劑組相比，口服Inarigivir 25 mg/d和50 mg/d、持續(xù)12周的患者，HBV DNA總體下降0.7log10，HBV RNA總體下降1.4log10；且小劑量Inarigivir毒性反應輕，耐受性較好，未發(fā)生嚴重不良反應事件[6]。在另一項臨床隊列研究中，未接受過治療的HBV患者口服Inarigivir 200 mg/d治療12周后，HBV DNA最多下降了3.3 log10；HBV DNA和HBV RNA以劑量依賴的方式減少，尤其在HBeAg陰性患者中降低更明顯[7]。該研究證實了Inarigivir在200 mg/d劑量下的安全性和抗病毒療效。

1.2 TLR-7激動劑 TLR-7在B淋巴細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞中表達，可激活B淋巴細胞轉化為漿細胞，增強肝細胞中抗原加工和呈遞，并在巨噬細胞和樹突狀細胞中誘導產生多種細胞因子和趨化因子，以激活感染時的防御反應。TLR-7激動劑包括GS-9620和JNJ-4964。

研究顯示，GS-9620能夠誘導腸道和肝臟中的漿細胞樣樹突狀細胞產生IFN-α，增加T淋巴細胞和NK細胞的反應，同時降低NK細胞抑制T淋巴細胞的能力，但血清HBsAg水平下降并不明顯[8]。體外細胞模型顯示，GS-9620誘導的Ⅰ型IFN可以持續(xù)抑制人原代肝細胞和終末分化肝細胞中的HBV，增強HBV抗原呈遞，但未減低核內共價閉環(huán)DNA(cccDNA)水平[9]。初步臨床試驗表明，GS-9620可以在沒有血清IFN的情況下誘導泛素蛋白ISG15生成，并在低劑量時增強T淋巴細胞和NK細胞反應；但其HBV DNA抑制率并不高于替諾福韋單藥，且在給藥12周后未觀察到患者HBsAg水平明顯改善，因此GS-9620治療宣告失敗[10]。

JNJ-4964在恢復免疫應答中起重要作用。動物試驗顯示，JNJ-4964治療AAV/HBV小鼠12周顯示出強大而持久的抗HBV活性，開始治療14 d后均檢測不到HBV DNA和HBsAg，且無ALT升高，隨訪結束前未觀察到HBV DNA和HBsAg反彈；從治療后21 d到隨訪結束時可觀察到HBsAg血清轉換和HBsAg特異性T淋巴細胞和B淋巴細胞反應，肝臟HBV DNA和HBV RNA水平分別下降了1.2 log10和0.5log10。該藥目前處在臨床開發(fā)階段，已證實可以刺激健康志愿者和CHB患者的免疫應答反應[11-12]。

1.3 TLR-8激動劑 TLR-8主要在單核巨噬細胞和髓樣樹突狀細胞中表達，在這些細胞中誘導激活以形成強大的Th1特征。TLR-8激動劑可誘導肝內單核細胞產生IL-12和IL-18，刺激肝內淋巴細胞產生大量IFN-c，激發(fā)肝臟的先天免疫反應[13]。

GS-9688是一種在臨床開發(fā)中的TLR-8選擇性小分子激動劑，在感染WHV的土撥鼠模型有限、短期的治療中具有良好耐受性，治療8周后及研究結束時，肝內WHV cccDNA、DNA和RNA下降了95%以上，并誘導持續(xù)對WHV DNA和肝炎表面抗原的抑制效應(治療結束后>5個月)，降低肝內cccDNA水平[14]。已公布的Ⅰa期臨床試驗結果顯示，口服GS-9688可誘導激活肝內細胞因子，以劑量依賴的方式激活NK細胞，并迅速上調其死亡配體TRAIL表達，具有良好的耐受性和藥效活性。目前該藥正繼續(xù)開展Ⅱ期臨床試驗。

1.4 胸腺素α1(Tα1) Tα1通過髓樣和漿細胞樣樹突狀細胞上的TLR2和TLR9發(fā)揮作用，可誘導樹突狀細胞和T淋巴細胞的活化和分化，以及細胞因子INF-γ和IL-2的啟動[15]。

在慢性WHV模型中，土撥鼠接受30周的Tα1治療后，WHV水平顯著下降，然而病毒載量在隨訪期間內恢復到了治療前水平；繼續(xù)觀察更長一段時間后，治療組肝細胞癌的發(fā)生率顯著低于未治療組[16]。在恩替卡韋聯(lián)合Tα1治療CHB的隨機對照臨床試驗中，治療結束后患者血清ALT、AST、TBIL均較治療前明顯下降，A/G高于治療前，聯(lián)合治療組AST、ALT及A/G改善優(yōu)于單用恩替卡韋治療組，HBV-DNA、HBeAg轉陰率高于單用恩替卡韋治療組[17-18]。這表明恩替卡韋聯(lián)合Tα1較單用恩替卡韋具有更高的抑制肝細胞癌發(fā)展的趨勢。

2 適應性免疫調節(jié)劑

適應性免疫反應對控制HBV感染具有重要作用，其中HBV特異性T淋巴細胞反應對于終止HBV感染至關重要。在CHB患者中，HBV特異性T淋巴細胞反應功能過早衰竭或缺失，程序性死亡受體1(PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞抗原4、細胞免疫球蛋白黏蛋白3、T淋巴細胞免疫球蛋白等多種抑制受體上調，脂肪酸氧化受損，活性氧生產過剩，線粒體功能障礙和效應T淋巴細胞缺陷；上述反應阻礙了適應性免疫應答對HBV病毒的清除[19]。因此，以宿主免疫為靶點，降低免疫低應答及無應答是治療CHB感染的重要手段。

2.1 免疫檢查點抑制劑 PD-1/PD-L1在免疫耐受中具有關鍵作用，PD-1/PD-L1阻斷劑能夠增加HBV抗體的產生和HBV特異性T淋巴細胞的數量和功能，從而介導HBV感染細胞的清除。但在CHB感染期間，由于抑制性PD-1/PD-L1軸被上調，導致HBV特異性T淋巴細胞功能障礙[20]。

對感染WHV的土撥鼠模型采用PD-L1阻斷劑聯(lián)合恩替卡韋治療后，病毒血癥和抗原血癥得到控制，其中部分動物在停止治療后，這一效應仍保持不變，表明PD-L1阻斷即使在停止治療后仍可以產生持久的抗病毒效果,且治療期間未發(fā)生嚴重不良反應[21]。體外實驗顯示，抗PD-1治療不僅能夠增加CHB患者抗HBs的B淋巴細胞數量，而且使B淋巴細胞成熟為分泌B淋巴細胞的能力增加了9.7倍。抗PD-1療法不僅能夠促進HBsAg特異性B淋巴細胞恢復，同時還能改善HBV特異性T淋巴細胞和特異性B淋巴細胞免疫應答。對HBeAg陰性的CHB患者給予PD-1抑制劑納武利尤單抗，24周時HBsAg滴度平均降低了0.5log10，而且在1例患者中實現了HBsAg持續(xù)清除和血清轉換[22]。FERRANDO-MARTINEZ等[23]認為，成功的抗病毒治療并不能將PD-1/PD-L1軸恢復到正常水平，但對HBeAg陰性患者給予抗PD-L1單克隆抗體MEDI2790治療后，可增加產生INF-γ的T淋巴細胞數量，還能使HBV特異性T淋巴細胞功能增強。以上研究表明，PD-1/PD-L1阻斷劑可能是恢復慢性HBV感染患者HBV反應性T淋巴細胞和B淋巴細胞功能的最有希望的方法。

2.2 治療性疫苗 治療性疫苗可通過誘導動態(tài)免疫反應來改善患者的預后，是提高當前抗病毒治療方案有效性的一種新方法。目前正在開發(fā)的治療性候選疫苗種類包括基于蛋白質/肽、基于活載體、基于DNA和基于細胞的疫苗療法[24]。

2.2.1 TG1050 TG1050是一種以腺病毒為基礎的治療性疫苗。在HBV感染小鼠模型中，TG1050可誘導肝內產生功能性T淋巴細胞，使其具有細胞毒作用并釋放細胞因子，在11～15周的觀察期結束后，HBV-DNA和HBsAg平均值分別下降了0.5log10和0.8log10[25]。在接受NUCs治療的CHB患者中完成的一項Ⅰb期臨床對照試驗顯示，TG1050誘導了HBV特異性細胞免疫應答，證實了TG1050的免疫原性以及其破壞CHB免疫耐受的能力[26]。目前該藥已進入Ⅱ期臨床試驗階段。

2.2.2 AIC649 AIC649是一種滅活的羊副痘病毒乙型肝炎疫苗，它能誘導自然的、自限性的免疫應答，從而增強患者自身針對病毒做出適當的免疫應答。首次應用于32例CHB患者的臨床研究顯示，AIC649單劑量靜脈注射具有較好的安全性和耐受性，可增加血漿IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ水平，同時降低血漿IL-10水平。接受治療的患者在抗HBe血清轉化時出現了HBeAg損失，盡管HBsAg水平沒有變化，但抗HBsAb呈陽性[27]。

2.2.3 GS-4774 GS-4774是含有HBV S蛋白、核心蛋白和X蛋白的治療性疫苗。一項替諾福韋單獨或聯(lián)合使用GS-4774的Ⅱ期臨床研究中，在治療24周和48周時，聯(lián)合用藥的患者可觀察到CD8+T淋巴細胞產生IFN-γ、TNF、IL-2的量增加，而在替諾福韋單獨治療的患者中沒有觀察到此變化。T淋巴細胞功能增強與Treg細胞數量減少相關，然而GS-4774治療最終并沒有降低患者的HBsAg水平，僅能夠刺激宿主CD8+T淋巴細胞反應，無法控制CHB進展[28]。

2.2.4 NASVAC 候選鼻用疫苗(NASVAC)中同時含有HBsAg和HBcAg重組蛋白。Ⅰ期臨床試驗結果表明，NASVAC在健康成年人中顯示出較好的耐受性、安全性且具有免疫原性[29]。在一項隨機對照的Ⅲ期臨床試驗中，160例CHB患者分別給予NASVAC和Peg-IFN治療，在治療結束時，兩組HBV病毒載量低于檢測下限的患者比例分別為62.5%、59.0%，組間比較差異無統(tǒng)計學意義；隨訪24周時，兩組HBV載量低于檢測下限的患者比例分別為57.7%、35.0%，NASVAC組高于Peg-IFN組。此外，與Peg-IFN相比，NASVAC更安全，并顯示出較低的肝纖維化進展[30]。

2.3 凋亡蛋白抑制因子(IAPs)拮抗劑 IAPs是一類高度保守的內源性抗凋亡分子，通過BIR結構域直接干擾Caspases蛋白水解活性，保護細胞免于死亡，并參與多種病原體識別受體信號通路[31]。CHB患者肝內表達IAPs增多，導致HBV感染的肝細胞出現免疫逃逸，不能被特異性T淋巴細胞所識別或攻擊，因此IAPs拮抗劑可以通過誘導HBV感染的肝細胞凋亡來特異性地消除細胞內cccDNA。

APG-1387是一種新型的以IAPs為靶點的SMAC模擬小分子抑制劑，可減少Treg分化、下調PD-1表達、誘導CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞分泌TNF-α和IFN-c，進而促進NK細胞增殖和增強T淋巴細胞功能。小劑量APG-1387可上調鈣網蛋白和HLA-DR表達，進而激活樹突狀細胞，增加抗原提呈；高劑量APG-1387可使體外培養(yǎng)的外周血單個核細胞中的NK細胞數量增加2倍以上[32]。鑒于APG-1387對免疫細胞的增強作用，以及APG-1387的低毒作用，將其與現有的免疫治療相結合是提高CHB免疫治療效果的可行途徑。目前該藥正在進行Ⅰ期臨床研究。

2.4 重定向T淋巴細胞 重定向T淋巴細胞是治療慢性HBV感染和HBV相關性肝癌的有效手段，可以提高T淋巴細胞受體對特定抗原的親和力。無論是T淋巴細胞工程表達HBV特異性T淋巴細胞受體(TCR)還是嵌合抗原受體(CAR)，都可以補充慢性HBV患者缺失或功能耗竭的HBV特異性T淋巴細胞。

研究顯示，從HBV慢性感染患者的淋巴細胞中獲得的表達HBV特異性受體的T淋巴細胞能夠產生抗病毒細胞因子，并選擇性地清除表達HBV的細胞，從而降低HBV復制[33]。KRUSE等[34]設計出一種針對HBsAg的CAR，以其構建的CAR-T淋巴細胞在體外能夠識別HBsAg顆粒和HBV+細胞，在人肝嵌合小鼠模型中能有效降低HBV-DNA和HBsAg水平。WISSKIRCHEN等[26]設計出能夠識別歐洲和亞洲HLA-A2亞型的高親和力HBV包膜或核心特異性TCR，將TCR移植的T淋巴細胞單次轉移到HBV感染的人源化小鼠中，病毒學標志物下降了4log10～5log10或低于檢測下限，顯示出強大的抗病毒潛力；當只有少數肝細胞被感染時，工程T淋巴細胞可特異性清除受感染的肝細胞，而不損害正常肝細胞。

雖然CAR-T淋巴細胞有著更廣泛的適用性，且不存在與內源性TCR鏈錯配的風險，但它們基于抗體的抗原識別結構域通常不像天然T淋巴細胞受體那樣敏感，需要更高的抗原負載才能激活T淋巴細胞；同時，生產CAR-T淋巴細胞需要專門的人員和基礎設施，經濟成本非常高，而且目前仍沒有研究表明該方法能夠安全有效地用于人類。這些都是工程化T淋巴細胞用于臨床亟待解決的問題。

隨著我們對CHB免疫發(fā)病機制的理解不斷完善，對于CHB免疫治療方式也有了新的認識，越來越多的免疫治療策略用來調節(jié)先天免疫和適應性免疫系統(tǒng)，通過宿主的先天性免疫應答和適應性免疫應答來控制HBV。CHB感染被認為是HBV特異性免疫耐受的結果，免疫治療可以打破免疫耐受和恢復HBV特異性免疫反應，在減少或消除cccDNA方面同樣具有巨大的潛力。即使目前免疫治療的新型藥物和生物制劑的療效及安全性仍存在較大的爭議，但隨著免疫治療領域的不斷研究，會出現更多的新技術，提供更有效的免疫調節(jié)劑配合NUCs使用，有望在不久的將來實現CHB的徹底治愈。