晚期膀胱癌免疫治療反應的生物標志物研究進展

張子威，張文濤，毛衛浦，姚旭東

1同濟大學附屬上海市第十人民醫院泌尿外科，上海200072；2海軍軍醫大學附屬長海醫院泌尿外科；3東南大學附屬中大醫院泌尿外科

膀胱癌是全球最普遍的惡性腫瘤之一，我國膀胱癌的患病率和病死率仍居高不下。根據膀胱癌的臨床TNM分期，可以將膀胱癌分為非肌層侵潤型膀胱癌、肌層侵潤型膀胱癌和轉移性膀胱癌。在過去幾十年中，晚期膀胱癌的治療方案都以聯合化療為主，但是其整體存活率一直不理想[1-2]。近年來，免疫治療在晚期膀胱癌的治療中取得了突破性進展，免疫檢查點抑制劑(ICI)的出現給晚期膀胱癌患者的治療帶來了希望。但如何精準識別對免疫治療敏感的優勢人群仍是目前亟待解決的問題。用于晚期膀胱癌免疫治療反應的相關生物標志物大致分為三類：第一類是與腫瘤細胞相關的標志物，如腫瘤內異質性、腫瘤基因突變負荷、DNA損傷修復、分子分型等；第二類是與腫瘤微環境相關的標志物，如腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)、程序性死亡蛋白配體1(PD-L1)等；第三類是與液體活檢相關的標志物，如游離DNA(cfDNA)、循環腫瘤DNA(ctDNA)、循環腫瘤細胞(CTC)等?，F將晚期膀胱癌免疫治療過程中可能存在的生物標志物綜述如下。

1 腫瘤細胞相關的標志物

1.1 腫瘤內異質性 腫瘤內異質性是指腫瘤細胞在其分子特征上不同，表現為同一腫瘤在不同時空可以存在多種不同基因型或亞型的細胞，這與癌癥的進展、治療抵抗和復發密切相關[3]。由此可以解釋，在臨床中，為何同一腫瘤在不同個體上甚至在同一個體不同時間節點上的免疫治療效果卻千差萬別。具有高腫瘤內異質性的患者對治療反應更差，這可能是腫瘤患者臨床預后不佳的一個標志物[4]。有學者認為，高腫瘤內異質性有利于免疫逃避，是因為新抗原數量越多，免疫反應就相對越差[5]。一項對6種腫瘤的249例患者進行全外顯子組測序的研究顯示，在膀胱癌中，具有高腫瘤內異質性(>50%亞克隆突變)的腫瘤對ICI無反應相關，并且與腫瘤細胞突變相關的特征往往是相互關聯的[6]。晚期膀胱癌是一種具有高度異質性的腫瘤，通過液體活檢和單細胞測序等技術來破譯膀胱腫瘤的異質性并揭示其潛在的分子機制具有重要的臨床意義。

1.2 腫瘤基因突變負荷 腫瘤基因突變負荷是指腫瘤細胞中每兆基因編碼區發生突變的總數，其在不同腫瘤、不同患者之間有很大的差別[7]。具有高腫瘤基因突變負荷的腫瘤患者，其同一節段外顯子編碼區中的突變堿基更多，可以產生更多的新抗原被抗腫瘤T淋巴細胞識別，從而激發抗腫瘤的免疫效應。突變相關新抗原是由非同義突變產生的突變蛋白，其免疫原性比其非突變的對應物更強。

生物信息學研究顯示，在膀胱癌中，高腫瘤基因突變負荷組傾向于促進CD4+、CD8+T淋巴細胞和NK細胞的滲透，腫瘤基因突變負荷較高的患者更有利于進行免疫治療[8]。由此推測，高腫瘤基因突變負荷一方面可能與新抗原的存在有關，另一方面可能與腫瘤基因突變負荷相關基因引起腫瘤微環境的變化相關。一項Ⅱ期臨床試驗也發現，高腫瘤基因突變負荷膀胱癌患者的病理緩解率更高，對于抗派姆單抗臨床治療的效果更好[9]。然而在有些腫瘤中，一些低腫瘤基因突變負荷的患者中也觀察到了對ICI的反應，即反應者與無反應者之間的腫瘤基因突變負荷范圍存在著顯著重疊[10]。也就是說，客觀的腫瘤反應并不是完全由體細胞突變所驅動，基因組或非基因組的特征改變也參與了抗腫瘤免疫反應。

由于目前在臨床中的檢測手段還不夠成熟、臨界值的界定還不夠明確以及腫瘤間和腫瘤內的異質性等因素的限制，使腫瘤基因突變負荷在臨床應用中作為免疫治療的標志物還面臨諸多困難。

1.3 DNA損傷修復 DNA損傷修復在癌癥進展中非常重要，當其調節失敗時，會導致更高的基因組不穩定性、突變率增加和腫瘤內異質性增強[11]。DNA損傷修復機制中的缺陷，包括微衛星不穩定(MSI)/錯配修復缺陷(dMMR)、DNA聚合體突變等。WANG等[12]通過cBioPortal數據庫分析DNA聚合酶ε/DNA聚合酶δ1(POLE/POLD1)在不同類型癌癥患者中的突變水平，結果顯示，非黑色素瘤皮膚癌患者的突變水平最高，膀胱癌患者的突變水平排在第5位，并且這些突變患者的腫瘤基因突變負荷明顯高于沒有突變的患者。

已有研究表明，在晚期膀胱癌患者中，DNA損傷修復基因突變可提高對順鉑化療的敏感性[13]。一項前瞻性試驗納入60例晚期膀胱癌患者，給予PD-1/PD-L1抑制劑后，在已知的或未明確的DNA損傷修復基因突變患者中，客觀緩解率均明顯高于沒有DNA損傷修復突變的患者[14]，這表明DNA損傷修復改變對晚期膀胱癌的免疫治療具有預測價值。VIDOTTO等[15]報道，DNA損傷修復基因突變與肌層浸潤性膀胱癌中腫瘤免疫檢查點基因表達有關，包括PD-1、PD-L1、IDO1、TIGIT、TIM-3、TGFB1、LAG3等，這表明某些特定DNA損傷修復基因的突變對免疫治療具有特殊的指導意義。

膀胱癌的生物學進展常伴隨多種DNA損傷修復基因的突變，因此，將DNA損傷修復缺陷狀態同其他腫瘤細胞相關生物標志物一起進行研究可以更好地預測對ICI的反應性。

1.4 分子分型 基因突變是否產生腫瘤新抗原不僅取決于突變的數量，與突變的類型也密切相關。根據膀胱癌的分子特點不同，膀胱癌的分子分型方法主要包括北卡羅來納大學(UNC)二分法、基因組圖譜(TCGA)四分法、安德森癌癥中心(MDA)三分法以及隆德大學(Lund)五分法。

一項PD-L1抑制劑阿特珠單抗在晚期膀胱癌中的Ⅱ期研究顯示，TCGA四分法中的管腔樣Ⅱ亞型患者有效率最好，為34%，而管腔樣Ⅰ亞型患者有效率最差，為10%[16]。與之類似的另外一項研究發現，盡管CD8+效應基因表達在基底Ⅲ/Ⅳ亞型中升高，但與管腔樣Ⅱ亞型相比，其反應率降低，強烈提示還存在其他免疫抑制因子在不同分型中發揮作用[17]。一項來自368個膀胱腫瘤樣本的轉錄組分析顯示，“基因組不穩定”的Lund亞型分類對免疫療法的反應性最佳[18]。其潛在的機制可能是與低水平的TGF-β表達和高突變/新抗原負荷相關，更大規模的臨床研究和分子機制還有待于進一步驗證。MC CONKEY等[19]則指出，在MDA三分法中p53樣型膀胱癌患者對化療明顯耐藥，提示對于p53樣型膀胱癌患者可優先考慮免疫治療方案。膀胱癌的分子分型對進一步了解膀胱癌患者的潛在免疫生物學特性以及開發合理的序貫治療策略具有重要意義。

2 腫瘤微環境相關的標志物

2.1 TILs TILs是存在于腫瘤微環境中的一群高度異質性免疫細胞，以CD4+、CD8+T淋巴細胞為主。TILs在腫瘤的發生發展中具有重要意義，與許多腫瘤的免疫治療反應及預后相關。LEKO等[20]報道，從5例膀胱癌患者的腫瘤組織中分離、培養TILs，發現1例之前接受過卡介苗治療的患者CD4+TILs亞群特異性識別了轉錄抑制因子CTBP1中的一個突變點。這一發現提示，新抗原反應性TILs存在于膀胱癌中，也就是說TILs升高有可能是膀胱癌患者對免疫治療敏感的一個標志。此外，在包括IMvigor210在內的研究中顯示，TILs的存在也預示著尿路上皮癌對ICI的反應有利[21]。TILs亞群與免疫治療的預后也具有相關性，CD8+TILs的存在與肌肉浸潤性尿路上皮癌患者的生存率提高有關，而免疫抑制調節性T淋巴細胞和巨噬細胞的存在與其生存率降低相關[22]。因此，腫瘤微環境中免疫細胞的數量和亞群對免疫治療的臨床獲益密切相關。

臨床中，腫瘤免疫微環境的改變對膀胱癌的治療具有重要的指導意義。由此推測，將腫瘤微環境中的標志物和腫瘤細胞本身的相關標志物結合，可能對免疫治療具有更強的陽性預測價值。

2.2 PD-L1 PD-L1是目前研究最為廣泛的免疫抑制劑預測性生物標志物，其表達情況通常以陽性表達率來表示。在一項單臂Ⅱ期KEYNOTE-052臨床試驗中顯示，在順鉑不耐受的晚期膀胱癌患者中，派姆單抗具有持久的臨床反應，并與總生存期延長相關，尤其是在PD-L1高表達的患者中[23]。在一項多中心Ⅲ期IMvigor130臨床試驗中發現，與化療相比，阿特珠單抗對不耐受順鉑治療且PD-L1表達較高的晚期膀胱癌患者的總生存期有著顯著改善[24]。以上研究不僅揭示了免疫抑制劑在晚期膀胱癌中的臨床意義，而且確立了PD-L1作為膀胱癌免疫治療生物標志物的地位。

在腫瘤的進程中，腫瘤細胞表面的PD-L1表達逐漸上升和T淋巴細胞表面的PD-1結合，是腫瘤細胞免疫逃逸的機制之一。從理論上來說，腫瘤細胞表面的PD-L1蛋白表達越多，患者對PD-L1/PD-1抑制劑的療效越好。但PD-L1的陰性預測價值相對較低。據報道，多達16%的PD-L1陰性的膀胱癌患者受益于ICI[9]。產生該現象的主要原因為：PD-L1檢測方式、判定手段不一致，另外腫瘤組織內的時間和空間異質性以及PD-L1表達的不穩定性也會影響最終的檢測結果；ICI不僅作用于T淋巴細胞，還可以調節腫瘤微環境中的其他細胞，并且對腫瘤基因突變負荷、特定基因的突變等都會產生影響；免疫系統是一個極其復雜的系統，即使是微小的差異也有可能產生截然不同的效益。因此，PD-L1單獨的作為預測因素來指導膀胱癌患者的治療顯然不夠充分。

3 液體活檢相關的標志物

在免疫治療過程中，外周血和其他血液標志物可以動態監測患者對ICI的反應性。例如，外周血樹突狀細胞升高與PD-L1通路負相關，可能參與膀胱癌患者的免疫逃逸[25]。有研究結果顯示，通過從外周血中分離游離DNA(cfDNA)、循環腫瘤DNA(ctDNA)或循環腫瘤細胞(CTC)，可作為ICI反應的預后和預測標志物[26]。目前，已有大量研究證實膀胱癌中的液體活檢生物標志物可以動態監測患者的預后、復發和藥物反應等[27]。

液體活檢在臨床中簡單易行、無需侵入性取樣、可重復性高，并且不易受到腫瘤內異質性的影響，相信未來會有更大規模的研究及更新進的技術來提高液體活檢的有效性和敏感度，進一步來監測膀胱癌的發生發展。

針對不同階段的膀胱癌患者，免疫治療不僅要考慮治療的有效性，還要考慮治療的安全性。隨著精準醫療的發展，新的免疫治療標志物的發現、檢測手段的進步、新興技術產生的大量數據以及極有可能聯合多種生物標志物進行評分來指導免疫治療等相關策略的出現，未來必定會有更細致、更準確的指導方案來規范免疫治療，最終實現膀胱癌患者的個體化貫序治療，減輕治療過程中帶來的痛苦以及改善患者的預后。