微小RNA-21對膿毒癥急性肺損傷小鼠肺組織的修復作用及其與PTEN的關系

葛晨，劉俊行，付優，賈麗靜，龍玲，杜全勝

1河北省人民醫院重癥醫學科，石家莊050000；2河北省兒童醫院骨科

膿毒癥是由感染誘發的宿主炎癥失調反應，可導致進行性器官功能障礙，其中最早受損的臟器是肺臟[1]，臨床上表現為急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征。流行病學研究顯示，膿毒癥患者中急性肺損傷的發生率達40%，病死率高達40%～50%[2]。膿毒癥急性肺損傷的病理機制復雜，包括炎癥因子釋放、氧化應激、免疫失調等。膿毒癥導致免疫細胞群體性過度活化，引起炎癥介質腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)等過度釋放，大量炎癥細胞聚集到肺部，導致急性肺損傷[3]。同時，在膿毒癥全身炎癥反應過程中，炎癥細胞被激活，合成和分泌大量活性氧，造成體內氧化—還原失衡，產生氧化應激狀態，損傷機體細胞、組織和器官，最終發展為器官功能障礙和衰竭。氧化應激反應與炎癥反應相互影響，相互促進，形成炎癥—氧化應激的惡性循環[4]。微小RNA(miRNA)是一類長度約22個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，它通過抑制靶基因翻譯調節蛋白表達，廣泛參與人體生長、分化、免疫應答及炎癥反應等生理過程，其表達及功能失調與心血管疾病、腫瘤、膿毒癥等疾病密切相關[5-6]。研究顯示，微小RNA-21(miR-21)在炎癥疾病中發揮調控作用[7]，并可通過負向調節磷脂酶和張力蛋白同源物(PTEN)影響細胞分化、生長和凋亡[8-10]。然而，目前miR-21與膿毒癥誘導的急性肺損傷是否相關尚不清楚。2019年9月—2020年3月，我們通過建立膿毒癥急性肺損傷小鼠模型，觀察小鼠肺組織中miR-21的表達情況，并用腺病毒轉染方法干預miR-21表達，觀察其對肺水腫、血清炎癥因子及氧化應激指標的影響，及其與PTEN的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康雄性昆明小鼠96只，體質量(30±5)g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。飼養于清潔級動物房，飼養條件為明暗12 h/12 h交替，溫度18～22 ℃，濕度40%～60%，自由進食、飲水。適應性飼養1周后用于實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器 載有miR-21前體或抑制劑的腺病毒(美國invitrogen公司)，PTEN抑制劑(Sigma公司，美國)，小鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(杭州聯科科技公司)，小鼠活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TRIzol提取液(美國Ambion公司)，miRNA逆轉錄試劑盒(美國GeneCopoeia公司)，RT-PCR試劑盒(美國GeneCopoeia公司)，PTEN抗體和羊抗兔抗體(美國KPL公司)。血氣分析儀(Premier 3000, 意大利GEM公司)，低溫離心機(德國Eppendorf公司)，紫外分光光度儀(日本Shimadzu公司)，反轉錄儀(美國ABI公司)，Real-time PCR System(美國ABI公司)。

1.2 動物分組干預與模型制備 采用隨機數字表法將小鼠分為假手術組(n=32)、模型組(n=32)、miR-21前體組(MP組，n=8)、miR-21抑制劑組(MI組，n=8)、miR-21前體+PTEN抑制劑組(MP+Anti-PTEN組，n=8)、miR-21抑制劑+PTEN抑制劑組(MI+Anti-PTEN組，n=8)。采用盲腸結扎穿孔術制備膿毒癥急性肺損傷模型。小鼠術前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg進行麻醉。仰臥位固定，腹部備皮、消毒，沿腹正中線切開腹壁約1.0 cm切口，探查分離盲腸，用18號無菌注射器針頭貫穿盲腸3次，后將穿刺盲腸還納至腹腔，并逐層縫合腹部切口。假手術組僅開腹后探查盲腸，不進行穿刺處理；模型組采用盲腸結扎穿孔術制備膿毒癥急性肺損傷模型；MP組、MI組于造模前4 d分別經尾靜脈注入載有miR-21前體和miR-21抑制劑的腺病毒0.2 mL(1×109pfu/mL)；MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組于造模前4 d分別轉染miR-21前體、miR-21抑制劑，于造模前30 min給予尾靜脈注射10 μg/kg PTEN抑制劑。

1.3 氧合指數(OI)測算 造模后24 h，每組各取8只小鼠，麻醉開腹，腹主動脈取血1 mL，使用血氣分析儀進行血氣分析，以氧分壓/吸入氧濃度計算OI。

1.4 肺組織濕重/干重比值(W/D)測定 完成血氣分析后，取小鼠左肺組織，用吸水紙吸干，置于電子天平稱重，記錄肺濕重；將肺組織置于70 ℃恒溫烘箱干燥48 h再次稱重，記錄肺干重，計算肺W/D。

1.5 血清炎癥因子TNF-α、IL-6和氧化應激指標ROS、SOD檢測 造模后24 h，取小鼠腹主動脈血2 mL，靜置后4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，取血清-80 ℃保存。采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。繪制標準曲線和回歸方程，測定樣品吸光度，代入標準曲線計算樣品濃度。

1.6 肺組織miR-21表達檢測 采用qRT-PCR法。取假手術組、模型組造模后6、12、24、48 h 各8只小鼠右肺組織，液氮速凍，-80 ℃保存，用于肺組織miR-21表達檢測；取凍存的肺組織，應用TRIzol提取肺組織RNA，使用超微量紫外分光光度計檢測純度和濃度，獲得高質量RNA。按照miRNA逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。miR-21引物序列：上游5′-GAAATGCCTCACAGCTATCGT-3′，下游5′-CCTCCA-CAAAGAGCCACC-3′。逆轉錄條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個循環。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-21的相對表達量。

1.7 干預miR-21表達對PTEN蛋白表達的調控作用觀察 取假手術組、模型組、MP組、MI組造模后24 h的右肺組織，液氮速凍，-80 ℃保存，用于檢測miR-21及PTEN蛋白表達。miR-21檢測方法參照“1.6”，PTEN蛋白檢測采用Western blotting法。取凍存的肺組織，稱取100 mg，加入裂解液后充分勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，BCA法測定蛋白質濃度。取100 μg蛋白樣品，加入上樣緩沖液，沸水變性5 min，電泳后將蛋白轉移到PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入PTEN抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次15 min。加入羊抗兔抗體(1∶5 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯色，用Image J軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白的灰度值與GAPDH的灰度值的比值代表目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 各組OI比較 假手術組、模型組、MP組、MI組、MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組OI分別為295±28、180±19、225±21、125±13、262±25、256±26。與假手術組比較，模型組OI降低(P<0.05)；與模型組比較，MP組、MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組OI均升高，MI組OI降低(P均<0.05)；與MP組比較，MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組OI升高(P均<0.05)；MP+Anti-PTEN組與MI+Anti-PTEN組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組肺W/D比較 假手術組、模型組、MP組、MI組、MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組肺W/D分別為4.0±0.4、7.3±0.7、6.1±0.5、9.6±0.8、4.8±0.5、4.9±0.5。與假手術組比較，模型組W/D升高(P<0.05)；與模型組比較，MP組、MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組W/D均下降，MI組W/D升高(P均<0.05)；與MP組比較，MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組W/D下降(P均<0.05)；MP+Anti-PTEN組與MI+Anti-PTEN組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各組血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平比較 與假手術組比較，模型組血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平升高(P均<0.05)；與模型組比較，MP組、MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平下降(P均<0.05)，MI組TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平升高(P均<0.05)；與MP組比較，MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平下降(P均<0.05)；MP+Anti-PTEN組與MI+Anti-PTEN組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組造模后24 h血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平比較

2.4 模型組造模后不同時間點肺組織miR-21表達變化 造模后6、12、24、48 h，模型組miR-21表達均較假手術組升高，造模后24 h達到峰值。見表2。

表2 假手術組和模型組造模后不同時間點肺組織miR-21表達比較

2.5 干預miR-21表達對PTEN蛋白表達的調控作用 與假手術組比較，模型組和MP組miR-21表達均升高、PTEN蛋白表達均下降，MI組miR-21表達下降、PTEN蛋白表達升高(P均<0.05)；與模型組比較，MP組miR-21表達升高、PTEN蛋白表達下降，MI組miR-21表達下降、PTEN蛋白表達升高(P均<0.05)。

表3 干預miR-21表達對PTEN蛋白表達的調控作用

3 討論

研究發現，多種miRNA在膿毒癥中表達異常，其中miR-122、miR-133a、miR-146a變化較為顯著，逐步成為早期診斷膿毒癥的生物標志物，在膿毒癥防治中發揮重要作用[11-13]。研究表明，miR-21參與多種疾病的炎癥反應，且存在抗炎作用。miR-21在過氧化氫誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡中起保護作用[14]，在動物試驗中證實可以減輕高氧性肺損傷[15]。而miR-21在膿毒癥急性肺損傷中的表達及如何發揮作用仍未可知。本研究結果顯示，膿毒癥急性肺損傷小鼠造模后6、12、24、48 h時miR-21表達水平均高于假手術組，24 h達到峰值，提示miR-21參與了膿毒癥急性肺損傷的過程。我們對小鼠通過注射載有miR-21前體或抑制劑的腺病毒干預miR-21表達，結果顯示，MP組肺組織miR-21表達較模型組升高，MI組肺組織miR-21表達較模型組下降。與模型組比較，MP組OI升高，W/D下降，MI組OI降低，W/D升高，表明增加miR-21表達可減輕膿毒癥小鼠肺損傷，而抑制miR-21表達會加重膿毒癥小鼠肺組織損傷。

在膿毒癥急性肺損傷的發病及病理過程中，免疫反應導致大量炎癥介質過度釋放。TNF-α是炎癥反應過程中出現最早的炎癥介質，能激發炎癥瀑布效應，促使IL-6、活性氧合成和釋放，加重炎癥反應；TNF-α可以損傷肺毛細血管細胞，增加血管通透性，導致肺水腫；還可通過直接損傷Ⅱ型肺泡上皮細胞，肺泡表面活性物質減少，進而出現肺泡萎陷[16]，臨床出現頑固性低氧血癥、難治性呼吸困難、紫紺等癥狀。本研究結果顯示，與模型組比較，MP組血清TNF-α、IL-6水平下降，MI組TNF-α、IL-6水平升高，說明上調miR-21表達可減輕膿毒癥小鼠機體炎癥反應。既往研究表明，多種miRNA通過抑制炎癥因子受體mRNA表達以減少炎癥介質的釋放[17]，提示miR-21可能通過與炎癥通路中mRNA結合促其降解，抑制炎癥反應，進一步改善臨床癥狀。

在膿毒癥發病過程中，除過度炎癥反應外，氧化應激也是膿毒癥急性肺損傷的重要發病機制之一，并且與炎癥反應相互促進。大量炎癥因子激活炎癥細胞，導致大量活性氧合成和分泌，形成氧化應激狀態。氧化應激對脂類、蛋白質產生強氧化作用，而這些物質是穩定細胞器和生物膜的重要成分，機體細胞的過氧化損傷導致組織缺血、水腫，造成組織器官損傷，進一步發展為器官功能障礙和衰竭。本研究結果顯示，與模型組比較，MP組血清ROS、SOD水平下降，MI組血清ROS、SOD水平升高。表明增加miR-21表達可減輕膿毒癥相關的炎癥反應和氧化應激反應，抑制miR-21表達后炎癥反應和氧化應激反應增加。miR-21可能通過減輕膿毒癥相關的炎癥反應及氧化應激反應，減輕炎癥因子及活性氧對肺毛細血管細胞及Ⅱ型肺泡上皮細胞的損傷，增加肺泡表面活性物質的釋放，進而減輕肺水腫及肺泡萎陷，使W/D下降、OI升高，改善呼吸困難及低氧血癥。

關于人類癌癥基因的研究顯示，PTEN是miR-21-5p的靶基因，miR-21-5p通過抑制PTEN進而抑制蛋白激酶B(Akt)通路，促進巨噬細胞極化和肺癌細胞凋亡。有研究認為，miR-21-5p可作用于PTEN/Akt信號通路，抑制Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡，進而保護肺組織[15]。Akt是一個重要細胞信號轉導通路，而PTEN是一種雙蛋白脂質磷酸酶，可負性調節Akt信號通路。本研究通過觀察miR-21變化對PTEN表達的影響，分析二者之間的關系，結果顯示，與假手術組比較，模型組PTEN表達下降；MP組上調miR-21后PTEN表達下降，而MI組下調miR-21表達后PTEN表達增加。這表明在小鼠膿毒癥急性肺損傷中PTEN是miR-21的作用靶點。為進一步驗證PTEN的作用，本研究采用PTEN抑制劑降低PTEN蛋白表達，結果顯示，與MP組造模后24 h比較，MP+Anti-PTEN組、MI+Anti-PTEN組TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平、W/D下降，OI升高，說明抑制PTEN后miR-21對減輕炎癥反應、氧化應激、改善肺損傷的作用更強，產生了累加效應。而MP+Anti-PTEN組與MI+Anti-PTEN組TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平、W/D、OI比較差異無統計學意義，說明PTEN被抑制后，上調或下調miR-21表達對膿毒癥中炎癥反應、氧化應激、改善肺損傷影響無差異，進一步驗證了PTEN確為miR-21的作用靶點。

綜上所述，膿毒癥小鼠急性肺損傷后肺組織中miR-21表達增加，增加miR-21表達可減輕膿毒癥小鼠炎癥反應及氧化應激從而減輕肺損傷；而抑制miR-21表達后可加重膿毒癥小鼠炎癥反應和氧化應激而加重肺損傷，其機制可能是通過抑制PTEN發揮保護作用。