基于網絡藥理學探討莪術—黃連藥對治療慢性萎縮性胃炎的作用機制

賈慶玲，王煜姣，叢軍，凌江紅，蔡淦

上海中醫藥大學附屬曙光醫院脾胃病科，上海200021

慢性萎縮性胃炎(CAG)是消化系統常見病和疑難病之一?！癈AG→腸上皮化生→不典型增生→胃癌”被認為是胃癌的經典演化模式，CAG伴腸上皮化生和異型增生者的胃癌發病率高達6%，因此防治CAG對降低胃癌發病率具有重要意義。中醫藥以其多途徑、多靶點治療疾病且不良反應少的優勢，在CAG防治中受到廣泛關注。首屆全國名中醫蔡淦教授認為，CAG伴癌前病變與瘀、熱、虛密切相關，瘀熱互結是癌前病變發生的關鍵環節，因此CAG治療應重視化瘀清熱，并依此創制莪連顆粒。該方重用莪術—黃連為君，莪術行氣破血、消積止痛，黃連瀉火解毒、清熱燥濕，兩藥合用以增化瘀清熱之功。現代藥理學研究表明，莪術具有抗腫瘤、抗炎鎮痛、抗菌、抗病毒、調血脂等多種藥理學作用[1]，黃連具有抗菌消炎、抗消化性潰瘍、抗腫瘤、降血脂、降血糖等藥理作用[2]。2021年1月—2月，我們基于中藥多成分、多靶點的特點，采用網絡藥理學方法，從整體上對莪術—黃連藥對以及疾病的靶點進行預測，分析藥物分子、靶點基因、通路以及疾病之間的關系，進一步揭示莪術—黃連藥對治療CAG的作用機制。

1 材料與方法

1.1 莪術—黃連藥對活性成分的篩選和靶點基因的獲取 通過TCMSP數據庫(https://tcmspw.com/index.php)分別檢索“莪術”“黃連”，以口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似度(DL)≥0.18作為篩選條件，篩選出莪術、黃連的活性成分及相應靶點基因，輸入UniPort數據庫(https://www.uniprot.org/)檢索相應靶蛋白，得到標準化基因名。

1.2 CAG相關靶點基因的獲取 通過GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)檢索關鍵詞“Chronic Atrophic Gastritis”，獲取CAG相關靶點基因，在UniPort數據庫中轉化為相應的標準化基因名。

1.3 莪術—黃連藥對的有效成分靶點基因和CAG共同靶點基因的篩選 將莪術—黃連藥對有效成分靶點基因和CAG相關靶點基因同時錄入VENNY2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)軟件，映射后構建維恩圖以獲取交集基因。

1.4 藥對—有效成分—靶點基因—信號通路—疾病相互作用的網絡構建與分析 String數據庫(https://string-db.org/)選擇“Multiple Proteins”，將共同交集基因輸入，蛋白種屬選擇“Homo sapiens”，最低相互作用閾值選擇“medium confidence(0.400)”，其他參數均保持默認設置，構建蛋白—蛋白相互作用(PPI)網絡。DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)對交集基因進行GO富集分析和KEGG通路分析(物種選“Homo sapiens”，以P<0.05作為顯著功能和通路的臨界值)。通過Cytoscape3.7.2軟件，構建莪術黃連藥對—活性成分—靶點基因網絡、藥對—有效成分—靶點基因—信號通路—疾病網絡，使用network analyzer功能進行網絡特征分析，根據度值預測治療節點，節點的大小與度值相關，節點越大說明該節點在網絡中越重要。

2 結果

2.1 莪術—黃連藥對的活性成分及靶點基因 通過TCMSP數據庫，根據OB≥30%和DL≥0.18篩選得到18個活性成分，其中12個化學成分藥動學特征良好，見表1。去除重復靶點基因和非人類靶點基因，得到180個靶點基因，獲得其相應標準基因名以構建藥對—活性成分—靶點基因網絡，見OSID碼圖1?；钚猿煞侄戎蹬琶叭某煞譃殚纹に?、(R)-Canadine、常春藤皂苷元，度值分別為143、28、22；靶點基因度值最高的基因為PTGS1、PTGS2、NCOA2、SCN5A、RXRA、KCNH2、AR，度值分別為9、9、8、8、8、8、8。

表1 莪術—黃連藥對活性成分表

2.2 莪術—黃連藥對活性成分靶點基因和CAG共同靶點基因篩選結果 通過GeneCards數據庫檢索獲得CAG靶點基因639個，利用UniPort數據庫將相關基因標準化。將莪術—黃連藥對活性成分靶點基因與CAG相關基因輸入VENNY2.1，得到交集基因78個，見表2。挑選78個交集基因中度值前25位的基因構建PPI網絡，共有25個節點、241個邊，見OSID碼圖2。Cytoscape分析顯示，度值排名前3位的基因為AKT1、IL-6、PTGS2，度值均為23。

表2 莪術—黃連活性成分靶點基因與CAG靶點基因交集表(前25位)

2.3 藥對與疾病共同靶點基因的GO富集分析和KEGG通路分析結果 對78個靶點基因進行GO富集分析和KEGG通路分析。設定閾值P<0.05，選取靠前的富集結果。見表3、表4。

2.4 莪術黃連藥對—有效成分—靶點基因—信號通路—疾病相互作用的網絡分析結果 基于以上結果，莪術—黃連藥對可能通過12個活性成分、78個靶點基因發揮對CAG的治療作用，以此構建莪術黃連藥對—有效成分—靶點基因—信號通路—疾病的相互作用網絡，見OSID碼圖3。

3 討論

CAG歸屬于中醫學“胃脘痛”“胃痞”范疇。莪連顆粒是首屆全國名中醫蔡淦教授的臨證驗方，由莪術、黃連、蒲公英等12味中藥組成，具有活血化瘀、清熱解毒、健脾理氣之功效，主治CAG伴腸上皮化生、異型增生。該方在臨床應用已30多年，具有逆轉CAG癌前病變的作用[3-4]。該方重用莪術—黃連為君，其中莪術味苦性辛溫，歸肝、脾經，功專行氣破血、消積止痛?！夺t家心法》：“凡行氣破血、消積散結皆用之”。黃連味苦性寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經，乃瀉火解毒，清熱燥濕，厚腸止瀉之佳品?！端庮惙ㄏ蟆罚骸盀a心火，除脾胃中濕熱，治煩躁惡心，郁熱在中焦，兀兀欲吐”。兩藥配伍應用，活血化瘀、清熱燥濕之功顯著?，F代藥理學研究表明，莪術有改善微循環、抗炎、抗氧化、抗腫瘤功效；黃連有保護胃黏膜、抗炎、抑殺幽門螺桿菌(Hp)、抗腫瘤等作用[1，5]。

表3 莪術—黃連藥對治療CAG的GO富集分析結果

表4 莪術—黃連藥對治療CAG的KEGG通路分析結果

本研究通過OB和DL評估，篩選出莪術—黃連藥對的12個有效活性成分，180個靶點基因，其中槲皮素、(R)-Canadine、常春藤皂苷元是藥對的主要活性成分，所對應的成分靶點相對較多，表明它們可能是莪術—黃連藥對治療作用的主要成分。靶點蛋白基因度值最高的基因為PTGS1(9)、PTGS2(9)、NCOA2(8)、SCN5A(8)、RXRA(8)、KCNH2(8)、AR(8)，表明莪術—黃連藥對可能作用于這些關鍵靶點基因。該網絡體現了一個活性成分可對應多個靶點蛋白，一個靶點蛋白可對應多個活性成分，表明莪術—黃連藥對的治療作用是一個復雜的過程。

基于David數據庫對交集基因進行GO富集分析和KEGG通路分析，結果表明，GO-BP分類主要涉及凋亡過程的負調控等。已有研究表明，CAG發展為癌變的發病機制與細胞增殖與凋亡相關。其中，促凋亡基因Bax、Fas的表達逐漸增高，而細胞增殖的負調控基因p16的表達逐漸降低[6-9]。GO-MF分類主要涉及酶結合等。研究表明，隨著CAG進展，胃蛋白酶和內在因子的產生逐漸減少[10]。KEGG通路分析顯示，莪術—黃連藥對治療CAG主要涉及TNF信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路等。其中，TNF信號通路作為主要通路，涉及TNF、MMP-9、AKT1、IL-6、IL-1β、MAPK1等靶點基因。動物實驗表明，CAG大鼠血清IL-6、TGF-β1和MAPK含量均存在不同程度的增加[11-12]。TNF-α、MMP-9、IL-1β、p-AKT1則在CAG患者胃黏膜組織或CAG大鼠血清中高水平表達[13-16]。上述結果表明，TNF信號通路在CAG發生、發展中發揮著重要作用。此外，CAG患者及模型大鼠胃黏膜組織中TLR4和NF-κB表達增高[17-18]。

PPI網絡分析發現，AKT1、IL-6等均為共同靶點，表明莪術—黃連藥對治療CAG可能主要涉及AKT1、IL-6等靶點基因。因此推測，莪術—黃連藥對可能通過調節AKT1、IL-6等靶點基因，TNF信號通路、MAPK信號通路從而發揮抗CAG作用。

本研究初步探討了莪術—黃連抗CAG的網絡藥理學機制，且所得結果與現有研究報道基本相符，為系統地開展莪術—黃連抗CAG的實驗研究和臨床應用提供了理論依據。但是，莪術—黃連藥對發揮抗CAG作用的深入研究仍待后續驗證。