干擾TOX基因聯(lián)合抗CD38 CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建及其對(duì)血液腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響

宋志茹，劉秀盈，朱晶晶，劉靜靜，馮婭茹，王建勛，2

1北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京102488；2深圳北京中醫(yī)藥大學(xué)研究院

血液系統(tǒng)惡性腫瘤主要包括淋巴瘤、白血病以及多發(fā)性骨髓瘤等，其中多發(fā)性骨髓瘤是一種克隆性漿細(xì)胞為特征的惡性腫瘤[1]，目前其主要治療藥物是免疫調(diào)節(jié)劑、蛋白酶體抑制劑、單抗類(lèi)藥物以和糖皮質(zhì)激素[2]。以硼替佐米為代表的蛋白酶體抑制劑及來(lái)那度胺為代表的免疫調(diào)節(jié)劑治療已經(jīng)取得較好的效果，但仍無(wú)法減少不良反應(yīng)及抑制腫瘤復(fù)發(fā)[3]。免疫治療是近年腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，嵌合型抗原受體基因修飾的T細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞)屬于細(xì)胞免疫治療[4]，是將特異性抗體與相對(duì)應(yīng)的抗原結(jié)合和T淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性同時(shí)發(fā)揮作用的一種方法[5]。將這種經(jīng)體外基因修飾后的T細(xì)胞回輸患者體內(nèi)，能夠識(shí)別特定腫瘤細(xì)胞，且不受主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的限制[6-7]。CD38抗原是一種跨膜糖蛋白，是漿細(xì)胞表面重要的標(biāo)志物[8]。CD38廣泛表達(dá)在多發(fā)性骨髓瘤、B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤、復(fù)發(fā)性急性淋巴細(xì)胞白血病等各種類(lèi)型的血液瘤細(xì)胞上，是CAR-T細(xì)胞免疫療法的一個(gè)合適的靶點(diǎn)[9]。但長(zhǎng)期腫瘤抗原及其他免疫抑制信號(hào)刺激使得CD38 CAR-T細(xì)胞功能逐漸衰減，發(fā)生T淋巴細(xì)胞耗竭，不能有效殺傷腫瘤細(xì)胞[10]。胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)高遷移率群體盒(TOX)蛋白是一個(gè)重要的DNA結(jié)合因子[11]，通過(guò)修飾局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及調(diào)節(jié)多蛋白復(fù)合物的生成進(jìn)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄，在T淋巴細(xì)胞發(fā)育和分化中具有重要調(diào)節(jié)作用[12]。研究表明，TOX高表達(dá)加速了血液腫瘤患者中T淋巴細(xì)胞的耗竭；反之，當(dāng)TOX表達(dá)下降時(shí)，T淋巴細(xì)胞耗竭的情況可顯著改善。2020年1月—2021年10月，本研究采用shRNA技術(shù)敲低TOX在重組CD38 CAR-T細(xì)胞中的表達(dá)，觀察其在體外抑制血液腫瘤細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人多發(fā)性骨髓瘤熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞RPMI-Luc和逆病毒包裝細(xì)胞系PG13購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，人Burkitt′s淋巴瘤熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞Raji-Luc購(gòu)自北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司。AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及PBS緩沖液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司，轉(zhuǎn)染試劑Fu Gene HD購(gòu)自美國(guó)Promega公司，白細(xì)胞介素2(IL-2)、CD3單克隆抗體OKT-3購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司，DH-5α感受態(tài)、MluⅠ酶、T4連接酶、NotⅠ酶、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自北京蘭博利德科技有限公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自上海優(yōu)寧維公司，干擾素γ(IFN-γ)ELISA試劑盒購(gòu)自北京百諾威生物公司，CD38-APC、MYC-PE、CD3-APC、PD-1-PE、CD69-PE抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，Heracell 240i)，高速離心機(jī)(Thermo，75006590)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Thermo Fisher，QuantStudio TM6 Flex)。

1.2 原代T淋巴細(xì)胞的提取 采集3例健康志愿者(男2例、女1例,知情同意)外周血，加入淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，重懸于含10% FBS、1%青—鏈霉素溶液的AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基。加入終濃度為100 ng/mL的OKT-3和100 U/mL的IL-2刺激T淋巴細(xì)胞活化增殖。每隔48 h用含100 U/mL IL-2的AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.3 TOX基因shRNA聯(lián)合抗CD38 CAR分子的構(gòu)建 親和力較強(qiáng)的CD38 CAR由本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選獲得，采用二代CAR結(jié)構(gòu)。首先將抗原識(shí)別片段CD38 ScFv、CD8鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)CD28與胞內(nèi)區(qū)CD3ζ串聯(lián)，并在ScFv區(qū)前加入MYC標(biāo)簽，便于后續(xù)檢測(cè)。然后通過(guò)GPP Web Portal網(wǎng)址設(shè)計(jì)靶向TOX的shRNA序列，另設(shè)計(jì)一條不針對(duì)任何靶點(diǎn)的無(wú)意義RNA序列作為對(duì)照。在這些設(shè)計(jì)好的RNA序列之前串聯(lián)U6啟動(dòng)子序列，完成shRNA靶向抑制TOX的CD38 CAR分子的構(gòu)建。對(duì)照組插入添加無(wú)意義RNA序列的抗CD38 CAR，命名為CD38 CAR；實(shí)驗(yàn)組CAR命名為T(mén)OX-shRNA1-CD38 CAR和TOX-shRNA2-CD38 CAR。以上CAR分子構(gòu)建完成后，酶切并連接逆病毒載體包裝質(zhì)粒pMFG，命名為pMFG-MYC-CD38 CAR、pMFG-TOX-shRNA1-MYC-CD38 CAR和pMFG-TOX-shRNA2-MYC-CD38 CAR。

1.4 CAR-T細(xì)胞的制備與分組 將pMFG-MYC-CD38-CAR、pMFG-TOX-shRNA1-MYC-CD38-CAR和pMFG-TOX-shRNA2-MYC-CD38-CAR質(zhì)粒載體進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝。經(jīng)逆病毒載體滴度檢測(cè)，CD38 CAR、TOX-shRNA1-CD38 CAR和TOX-shRNA2-CD38 CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)PG13細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分別為77.4%、78.6%和83.7%，逆病毒載體滴度均>1 107 copies/mL，表明逆病毒載體滴度達(dá)到轉(zhuǎn)導(dǎo)要求，可進(jìn)行后續(xù)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。提取分離原代T淋巴細(xì)胞后培養(yǎng)48 h，將其分為CD38 CAR-T組、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組，分別轉(zhuǎn)導(dǎo)CD38 CAR、TOX-shRNA1-CD38 CAR和TOX-shRNA2-CD38 CAR，獲得CD38 CAR-T細(xì)胞、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T細(xì)胞和TOX-shRNA2-CD38 CAR-T細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h后，用流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)MYC-PE抗體染色檢測(cè)抗原表達(dá)，計(jì)算轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率=MYC-PE陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總活細(xì)胞數(shù)×100%。以轉(zhuǎn)導(dǎo)效率達(dá)到40%以上為成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 CAR-T細(xì)胞TOX mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用RT-QPCR法。轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h后，三組各取5×106個(gè)活細(xì)胞，提取RNA，凝膠電泳驗(yàn)證其完整性，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR green進(jìn)行RT-QPCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算TOX mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.6 CAR-T細(xì)胞增殖能力觀察 轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h后，加入染色劑，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀讀取三組細(xì)胞密度，之后每48 h計(jì)數(shù)并繼續(xù)傳代培養(yǎng)，維持細(xì)胞密度為5×105/mL，計(jì)算單次生長(zhǎng)倍數(shù)(即本次計(jì)數(shù)時(shí)細(xì)胞密度與上次計(jì)數(shù)時(shí)的細(xì)胞終密度的比值)。單次生長(zhǎng)倍數(shù)的乘積即生長(zhǎng)倍數(shù)，其中第0天(提取PBMC當(dāng)天)單次生長(zhǎng)倍數(shù)、生長(zhǎng)倍數(shù)均定為1。記錄0～10 d體外培養(yǎng)生長(zhǎng)倍數(shù)的對(duì)數(shù)值，繪制增殖曲線。

1.7 CAR-T細(xì)胞與血液腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后活化情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取Raji-Luc、RPMI-Luc細(xì)胞，加入CD38-APC避光染色60 min，PBS沖洗，重懸在PBS中，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示Raji-Luc、RPMI-Luc細(xì)胞表面CD38表達(dá)效率分別為95.21%±0.80%和96.34%±3.76%，表明本實(shí)驗(yàn)采用的血液腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)CD38，可作為抗CD38 CAR-T細(xì)胞的靶細(xì)胞。取三組CAR-T細(xì)胞，分別與等量血液腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，400 g離心5 min，收集細(xì)胞。PBS沖洗，加入CD3-APC、CD69-PE避光染色60 min，PBS緩沖液沖洗1遍，重懸在PBS中，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，讀取CAR-T細(xì)胞與血液腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞表面CD69的表達(dá)效率，以此反映CAR-T細(xì)胞活化情況。

1.8 血液腫瘤細(xì)胞刺激下CAR-T細(xì)胞體外增殖能力觀察 采用CFSE染色法。取Raji-Luc、RPMI-Luc細(xì)胞，加入含IL-2的AIM-Ⅴ完全培養(yǎng)基，稀釋至細(xì)胞密度4×104/100 μL，按100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板。取三組CAR-T細(xì)胞，加入CFSE熒光染料，37 ℃避光孵育30 min。將細(xì)胞按1×104/孔加入預(yù)設(shè)孔中，最終效靶比設(shè)為1∶4。培養(yǎng)24 h后，用CD3-APC抗體染色標(biāo)記T淋巴細(xì)胞以區(qū)分效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)比CFSE熒光信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)衡量細(xì)胞增殖情況，CFSE標(biāo)記的是CAR-T細(xì)胞，當(dāng)CAR-T細(xì)胞增殖時(shí)CFSE信號(hào)會(huì)遞減，故CFSE信號(hào)越弱表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.9 CAR-T細(xì)胞對(duì)血液腫瘤細(xì)胞殺傷能力觀察 采用熒光素酶化學(xué)發(fā)光法。分別制備Raji-Luc、RPMI-Luc細(xì)胞懸液，參照1.8中鋪板方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)鋪板。將CAR-T細(xì)胞與Raji-Luc、RPMI-Luc靶細(xì)胞分別以1∶2、1∶4、1∶8的效靶比與CD38 CAR-T組、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組細(xì)胞共培養(yǎng)，只加入Raji-Luc細(xì)胞或RPMI-Luc細(xì)胞的孔標(biāo)記為最大釋放孔，加入培養(yǎng)基的孔作為空白孔。共培養(yǎng)6 h后，每孔加入100 μL熒光素酶底物，室溫避光培養(yǎng)5 min。設(shè)置化學(xué)發(fā)光模式，全白酶標(biāo)板，震板時(shí)間5 s，同步超快光子計(jì)數(shù)的低噪音光電倍增管(PMT)設(shè)為500。殺傷效率的計(jì)算公式為：殺傷效率=1-(實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞凋亡率-空白孔細(xì)胞凋亡率)/(最大釋放孔細(xì)胞凋亡率-空白孔細(xì)胞凋亡率)×100%。

1.10 血液腫瘤細(xì)胞刺激下CAR-T細(xì)胞IFN-γ釋放水平檢測(cè) 采用ELISA法將三組CAR-T細(xì)胞與Raji-Luc、RPMI-Luc細(xì)胞分別共培養(yǎng)6 h(效靶比為1∶2)，400 g離心5 min，取上清，使用ELISA試劑盒檢測(cè)IFN-γ水平。

1.11 CAR-T細(xì)胞耗竭情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取CAR-T細(xì)胞懸液，400 g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞。PBS沖洗，同時(shí)加入CD3-APC、PD-1-PE抗體避光孵育60 min。PBS洗滌，棄上清并重懸于PBS，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CAR-T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)，通過(guò)PD-1表達(dá)量衡量CAR-T細(xì)胞耗竭情況。

2 結(jié)果

2.1 三組CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測(cè)結(jié)果 CD38 CAR-T組、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率分別為41.51%、41.28%、44.84%，均超過(guò)40%，表明CAR分子在T淋巴細(xì)胞表面成功表達(dá)。

2.2 三組CAR-T細(xì)胞TOX mRNA表達(dá)水平比較 CD38 CAR-T組、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組TOX mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1、0.84±0.14、0.68±0.70。TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組TOX mRNA表達(dá)水平低于CD38 CAR-T組(P<0.05)，TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組TOX mRNA表達(dá)水平與CD38 CAR-T組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組的TOX mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低30%以上，表明其RNA干擾效果較好。

2.3 三組細(xì)胞增殖能力比較 CAR-T細(xì)胞在體外培養(yǎng)0～10 d的生長(zhǎng)倍數(shù)對(duì)數(shù)值見(jiàn)表1，三組CAR-T細(xì)胞在體外均能穩(wěn)定增殖，三組CAR-T細(xì)胞生長(zhǎng)倍數(shù)對(duì)數(shù)值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 CAR-T細(xì)胞的體外增殖的生長(zhǎng)倍數(shù)對(duì)數(shù)值

2.4 CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞表面CD69表達(dá)效率比較 與等量腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，三組細(xì)胞表面CD69表達(dá)效率均升高(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 三組細(xì)胞在與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后表面CD69表達(dá)效率比較

2.5 CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后增殖情況比較 與CAR-T單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)相比，三組CAR-T細(xì)胞與Raji-Luc、RPMI-Luc細(xì)胞共培養(yǎng)后FITC信號(hào)左移，表明CAR-T細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞的刺激下增殖加快，CAR-T細(xì)胞被腫瘤細(xì)胞激活。見(jiàn)圖2。

注：a為CAR-T與Raji-Luc共培養(yǎng)；b為CAR-T與RPMI-Luc共培養(yǎng)；c為CAR-T單獨(dú)培養(yǎng)。

2.6 三組細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率比較 三組細(xì)胞分別與Raji-Luc、RPMI-Luc細(xì)胞共培養(yǎng)后，在不同效靶比時(shí)，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組的殺傷效率均高于CD38 CAR-T組(P<0.05或<0.01)，TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組與CD38 CAR-T組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2、表3。

2.7 三組細(xì)胞在血液腫瘤細(xì)胞刺激下IFN-γ釋放水平檢測(cè) TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組IFN-γ釋放水平較CD38 CAR-T組升高(P<0.05)，TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組與CD38 CAR-T組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表2 三組細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對(duì)Raji-Luc細(xì)胞的殺傷效率比較

表3 三組細(xì)胞在不同效靶比時(shí)對(duì)RPMI-Luc細(xì)胞的殺傷效率比較

表4 三組細(xì)胞在Raji-Luc、RPMI-Luc細(xì)胞刺激下IFN-γ釋放水平比較

2.8 三組CAR-T細(xì)胞耗竭情況比較 CD38 CAR-T組、TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組、TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組PD-1表達(dá)效率分別為32.55%±4.88%、26.45%±5.45%、16.50%±2.97%。與CD38 CAR-T組相比，TOX-shRNA1-CD38 CAR-T組PD-1表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組PD-1表達(dá)下降(P<0.05)。

3 討論

在過(guò)去的幾十年里，血液腫瘤常規(guī)治療以藥物治療為主，嚴(yán)重者需手術(shù)、放化療。但這些治療方法僅能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，無(wú)法徹底殺死腫瘤細(xì)胞，因此多數(shù)血液腫瘤患者最終進(jìn)展至復(fù)發(fā)難治階段甚至死亡。CAR-T細(xì)胞療法的原理是通過(guò)基因工程技術(shù)將抗原分子的抗體可變區(qū)基因序列與淋巴細(xì)胞免疫受體的胞內(nèi)區(qū)序列融合成嵌合分子，再利用病毒載體介導(dǎo)嵌合分子轉(zhuǎn)導(dǎo)T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞表面即可表達(dá)融合蛋白，經(jīng)CAR分子修飾后的T淋巴細(xì)胞具備靶向抗腫瘤活性，且不受到MHC的限制。靶向腫瘤限制性抗原是CAR-T治療成功的關(guān)鍵，由于CD38可以在惡性B細(xì)胞瘤上長(zhǎng)時(shí)間地表達(dá)，使其成為CAR-T細(xì)胞治療的一個(gè)研究靶點(diǎn)[13]。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是對(duì)病毒感染和惡性腫瘤保護(hù)性免疫的重要介質(zhì)。然而，長(zhǎng)期暴露在同種抗原下往往會(huì)削弱T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)能力，限制其治療潛力，我們稱(chēng)之為T(mén)淋巴細(xì)胞耗竭。CAR-T細(xì)胞回輸?shù)襟w內(nèi)后，必須擴(kuò)增到一定數(shù)量并存活足夠長(zhǎng)的時(shí)間才能有效殺傷腫瘤細(xì)胞，CAR-T細(xì)胞功能衰竭會(huì)降低CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤的治療效果。臨床試驗(yàn)表明，TOX與耗竭的T淋巴細(xì)胞高度相關(guān)，TOX通過(guò)上調(diào)腫瘤中的IC蛋白促進(jìn)腫瘤內(nèi)T淋巴細(xì)胞耗竭，其可能是促進(jìn)患者T淋巴細(xì)胞耗竭的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[14]。因此調(diào)節(jié)耗竭T細(xì)胞TOX表達(dá)可能為提高血液腫瘤免疫治療效果提供新的策略[15]。

本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的CD38 CAR-T細(xì)胞的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)TOX基因shRNA聯(lián)合抗CD38 CAR分子，包裝為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并成功轉(zhuǎn)導(dǎo)人原代T淋巴細(xì)胞，成功構(gòu)建TOX-shRNA-CD38 CAR-T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組與CD38 CAR-T組相比TOX mRNA表達(dá)水平下降，這表明shRNA2序列靶向性更強(qiáng)；三組細(xì)胞培養(yǎng)0～10 d的生長(zhǎng)倍數(shù)對(duì)數(shù)值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明三組細(xì)胞體外均能穩(wěn)定增殖；本研究采用Raji-Luc和RPMI-Luc兩種高表達(dá)CD38的細(xì)胞系作為靶細(xì)胞，在相同的體外培養(yǎng)條件下，三組細(xì)胞在分別與兩種靶細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)比三組細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)其表面CD69的表達(dá)均更高，細(xì)胞表面糖蛋白CD69是T細(xì)胞活化的另一個(gè)標(biāo)記，因此我們得知在對(duì)應(yīng)靶抗原刺激下，三組 CAR-T細(xì)胞均被激活；從CFSE結(jié)果來(lái)看，三組CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后FITC信號(hào)均左移，表明CAR-T細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞的刺激下增殖加快。隨后我們用這三組細(xì)胞以效靶比1∶2、1∶4、1∶8分別作用于Raji-Luc和RPMI-Luc細(xì)胞，觀察其殺傷效率，結(jié)果顯示TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組殺傷效率強(qiáng)于CD38 CAR-T組。T細(xì)胞耗竭或功能障礙表現(xiàn)為減少細(xì)胞因子和效應(yīng)分子的表達(dá)，上調(diào)抑制性受體PD-1的表達(dá)[16]，而T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)會(huì)釋放細(xì)胞因子IFN-γ，檢測(cè)IFN-γ也可從側(cè)面反映T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。三組細(xì)胞殺傷Raji-Luc、RPMI-Luc細(xì)胞后，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組IFN-γ釋放水平較CD38 CAR-T組升高，且TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組與不同靶細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)IFN-γ釋放量均高于2 000 pg/mL，這說(shuō)明TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組細(xì)胞被靶抗原激活后產(chǎn)生大量IFN-γ細(xì)胞因子。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組與CD38 CAR-T組相比PD-1表達(dá)水平降低，即TOX-shRNA2-CD38 CAR-T組細(xì)胞耗竭因子水平更低。這提示抑制CAR-T細(xì)胞TOX表達(dá)可以提高其增殖能力和殺傷腫瘤的能力，起到減緩T細(xì)胞耗竭的作用。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了抑制TOX基因聯(lián)合抗CD38 CAR-T細(xì)胞，即TOX-shRNA-CD38 CAR-T細(xì)胞，其能有效抑制TOX表達(dá)，經(jīng)靶抗原激活后增殖能力及抗腫瘤能力顯著增強(qiáng)，且TOX-shRNA-CD38 CAR-T細(xì)胞的耗竭也得到改善。T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)能力是影響CAR-T細(xì)胞治療效果的關(guān)鍵問(wèn)題之一，基于構(gòu)建的TOX shRNA系統(tǒng)聯(lián)合CD38 CAR-T的良好效果不需要與小分子免疫檢查點(diǎn)抑制劑同時(shí)使用，也可達(dá)到增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞活性，在一定程度上提高治療效果，免去了對(duì)于小分子藥物與重組CAR-T細(xì)胞聯(lián)用時(shí)劑量的摸索，使得增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞抗腫瘤能力以及減緩衰竭的方法更加高效便捷，未來(lái)TOX基因shRNA聯(lián)合CAR-T的實(shí)驗(yàn)方案在血液腫瘤和實(shí)體腫瘤的治療方面具有良好的應(yīng)用前景。