單欄飼喂對灘羊應激激素的影響

張 倩，任 敏，茍 妍，陶金忠

（寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021）

0 引言

應激（Stress）這一觀點最先是由加拿大的病理生理學家Hans Selye于1936年在《Nature》雜志上首次提出的。其基本定義被認為泛指機體在遭遇內外部刺激性因子的相互刺激下，所觸發的一系列非特異性生理防御機制，其中，下丘腦垂體腎上腺的激活過程是整個反應過程中最主要的一種[1-3]。下丘腦垂體中的腎上腺軸突的活動直接受到位于下丘腦垂體中心室旁核（paraventricular hypothalamicnucleus，pvn）活動的影響。當機體大腦受到強烈刺激時，室旁核神經細胞分泌精氨酸加壓素（avon）和促腎上腺皮質激素，從而使垂體產生和分泌促腎上腺皮質激素（Adreno-cortico-tropic-hormone，ACTH）。促腎上腺皮質激素隨著血液流動到達腎上腺，刺激腎上腺皮質合成和分泌皮質醇[5-7]。隨后，ACTH刺激腎上腺皮質釋放皮質醇，而皮質醇反過來又向垂體提供負反饋，減少促腎上腺皮質激素的分泌，皮質醇是腎上腺在面臨壓力時產生的一種糖皮質激素，具備抑菌、抗炎、抗過敏、抗病毒等的作用，可顯著的增強中樞神經系統的興奮性[8]。正常情況下，機體通過控制皮質醇分泌和調節血液中皮質醇的含量來保持正常的生理功能。在應激狀態下，機體內源性皮質醇產生量激增（至正常程度的10倍上下)來抵擋刺激，并產生針對性的應激反應。血液中的皮質醇濃度是權衡激素強度的一個指標。生產實踐中，常用測量血液中乳糖皮質醇的平均含量值來評定奶牛的應激和其他疾病狀態，但其濃度可能會同時受到血液采樣和應激等因素的嚴重干擾[9-10]。

近年來，隨著畜牧業的快速發展，應激的防治成為獸醫臨床關注的重點。大量研究表明，動物應激受生理性因素、環境性因素、管理性因素以及藥物性因素的影響。長途運輸后肉牛會出現運輸應激綜合征導致應激激素水平增加，也可能減少蛋白質的合成，降低生產性能和泌乳能力[11-13]。流行病學研究顯示，應激刺激嚴重者可以使蛋雞產蛋率從85%驟降到15%；德國每年由于運輸應激而死亡的屠宰肉豬比例大約是0.2%；美國因運輸應激而死亡的豬比例也很高，每年將近損失3 000萬美元。可見，應激嚴重危害動物的健康。已成為亟待解決的問題之一。

在動物實驗中，單欄飼喂是經常使用的一種飼養方式。單欄飼喂，雖便于飼喂管理，但限制了動物的活動及生存空間，是否會對動物產生應激，目前尚不清楚。本試驗通過比較單欄飼喂和圈舍喂養兩種不同飼喂方式對灘羊應激激素水平的變化，探究單欄飼喂對灘羊應激的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

常用儀器與試劑，見表1。

1.2 試驗動物與分組

本試驗于2019年8—9月份從寧夏鹽池灘羊育種場選取24只健康無病、月齡相近的灘羊，并隨機將其分為2組（實驗組與對照組），每組各12只，2組灘羊均飼喂基礎飼糧，試驗組進行單欄飼喂，對照組進行圈舍飼喂。分別于第1 d、第14 d和第24 d晨飼前采集試驗灘羊頸靜脈血樣10 mL，加入肝素鈉抗凝，在3 000 rpm條件下離心15 min后獲得血漿，置于-20℃冰箱中冷凍保存待檢。

1.3 樣本預處理

從-20℃冰箱中取出血樣，緩慢解凍后至常溫，使用ELISA試劑盒檢測第1 d、第14 d和第24 d血漿樣品中皮質醇和ACTH含量。

1.4 ELISA檢測

1）標準品的稀釋和樣品的添加:在酶標包被板上分別依序設置1個符合標準的乳化樣品10孔，在第1和第2孔中分別依次稀釋加入1個符合標準的乳化樣品100μL，并且在第1和第2孔中分別依次加入2個標準新產品稀釋液50μL依次混勻，然后從第1孔和第2孔中各取100μL分別依次加入混勻到第3孔和第4孔中，接著在第3孔和第4孔分別依次加2個標準品稀液50μL，混勻，然后再從第3孔和第4孔中分別取50μL混勻棄掉，再各取50μL分別依次加到第5和第6孔中，再在第5和第6孔中依次加入2個標準新產品稀釋液50μL，混勻，混勻后從第5孔和第6孔中分別取50μL依次加到第7孔和第8孔中，再從第7孔和第8孔中分別依次加2個標準新產品稀釋液50μL，混勻后再從第7孔和第8孔中分別取50μL依次加到第9孔和第10孔中，再從第9孔和第10孔分別依次加入2個標準新產品稀釋液50μL，混勻后從第9孔和第10孔中分別取50μL別棄掉。（使用皮質酸乙醇溶液稀釋后各孔徑添加樣物含量都為50μL，質量濃度分別為300、200、100、50、2.5μg/L；ACTH（稀釋后各孔徑添加樣物含量都為50μl，質量濃度分別為90、30、15、7.5 ng/L）。

2）加樣:分別設空缺孔（即在空缺對照板的孔隙內不加待測樣品及其他酶標待測試劑，別的各步加樣操縱并無差異)、待檢預測酶標樣品孔，在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加空缺待檢預測酶標樣品10μL（待測樣品最后的稀釋度為5倍），將待測樣品試劑加于原酶標板孔底部，（盡量不直接碰觸孔壁，輕輕左右搖晃使其混勻）。

3）溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

4）配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

5）洗滌:注意要仔細揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，同上步驟反復5次，拍干。

6）加酶:每孔選項加入帶有酶標記的試劑50μL，空白孔選項除外。

7）溫育:操作同3。

8）洗滌:操作同5。

9）顯色:每孔先加入顯色劑B50μL，輕輕搖晃使之均勻混合，37℃避光顯色15 min。

10）反應終止:每孔中添加一次終止液50μL之后該孔停止化學反應（此時孔由藍色逐漸變為金黃色）。

11）測定:以空缺孔調零，420 nm波長依序丈量各孔的吸光度（OD值），測定應在加停止液之后15 min之內進行。

1.5 統計分析

首先通過Excel對測量數據進行排序后，采用SPSS 23.0軟件對數據進行t檢驗顯著性分析，所得的數據用“平均值±標準差”表示，顯著性水平為（P＜0.05）。

2 結果

2.1 標準曲線

ACTH標準曲線為Y=46.435X+2.313 5，R2=0.984 8；皮質醇標準曲線為Y=188.54X+1.998，R2=0.987 7。說明兩個曲線擬合良好。式中:X為溶液濃度，Y為吸光度。

2.2 對照組與試驗組皮質醇與ACTH濃度變化

由表2可知，隨著實驗的進行，皮質醇濃度隨時間的變化而呈下降趨勢，且在3個時間點對照組與試驗組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 皮質醇濃度隨時間變化情況

由表3可知，隨著實驗的進行，ACTH濃度隨時間的變化各組ACTH呈上升趨勢，在第24 d時，對照組ACTH濃度極顯著高于試驗組（P＜0.01）。

表3 ACTH濃度隨時間變化情況

3 討論與結論

研究發現，動物在急性應激下，皮質醇激增。雖然最開始是在促腎上腺皮質激素水平大幅上升之前皮質醇才開始升高，但如果出現長期的炎癥應激，促腎上腺皮質激素的水平會恢復到相近于基礎水平，而皮質醇水平則由于腎上腺敏感性的增加而持續上升；在慢性應激狀態下，垂體的下丘腦激活由促腎上腺皮質激素釋放激素為主轉變為精氨酸后葉加壓素為主，皮質醇水平持續升高，至少部分原因是皮質醇代謝下降[14-15]。

大鼠在恐懼應激條件下其血漿中ACTH和皮質醇在血清中的含量明顯高于常規，ACTH和皮質醇的含量可以反映垂體-腎上腺皮質軸的功效轉變[16]。另有研究表明，當奶牛患有子宮內膜炎等疾病時，毛發中皮質醇濃度會升高，而當奶牛處于亞臨床疾病狀態時，毛發中皮質醇含量沒有明顯升高[17-21]。在國內，每年有超過5 000萬頭牛通過半掛車被運輸，有研究表明，當奶牛在運輸壓力下，血清中的ACTH和皮質醇含量都會上升。當奶牛處于急性熱應激時，血清皮質醇的含量也會升高，說明在應激刺激下，機體作為回應，其應激素ACTH和皮質醇會升高。

皮質醇用作評估動物壓力程度的指標，其具有支持或調控機體代謝、免疫及穩態的功能，各種生理或病理因素會影響血漿皮質醇激素含量的變化。宋鵬康等人[22]研究發現，在妊娠前、中、后期，與自由產圈的相比，限位欄產圈下母豬皮質醇含量有一定程度的增加但差異不顯著。本試驗結果表明，單欄飼喂與圈舍飼養下2組灘羊血漿皮質醇激素水平差異不顯著。這與宋鵬康[22]等人的研究結果基本相一致。說明單欄飼喂雖然限定了羊只自由活動，但不影響灘羊皮質醇的分泌。上述試驗經由神經內分泌和血液生理指標的轉變，提高人體適應環境轉變的本領，從而保證生命活動的正常進行。在單欄飼喂第24 d的灘羊ACTH濃度低于對照組，說明在單欄飼喂的過程中，皮質醇和ACTH兩種應激激素的分泌并未受到顯著影響，推斷單欄飼喂不對灘羊產生應激反應或受到的應激反應很小。