酶抑制-比色法農(nóng)殘速測試劑盒檢測蔬菜農(nóng)藥殘留的結(jié)果分析

羅俊霞，趙建波，宋 偉，賈 冬，葉 茂，余寅曦，包 方，劉 宇，張 婧，楊亞楠，趙利敏

（1.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，河南鄭州 450006；2.鄭州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，河南鄭州 450002；3.河南省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，河南鄭州 450002；4.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司，浙江杭州 311258 5.河南省農(nóng)業(yè)對外經(jīng)濟(jì)合作中心，河南 鄭州 450002）

0 引言

自2001年農(nóng)業(yè)部以蔬菜為切入點(diǎn)在全國37個大中城市開始無公害農(nóng)產(chǎn)品行動計劃以來，農(nóng)產(chǎn)品的安全問題受到人們的廣泛關(guān)注，農(nóng)產(chǎn)品檢測監(jiān)管成為各級農(nóng)業(yè)主管部門的重要工作，植物性農(nóng)產(chǎn)品的檢測與監(jiān)管以農(nóng)藥殘留的監(jiān)管為主。《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》和2015年修訂的《中華人民共和國食品質(zhì)量安全法》賦予快速檢測做為檢測手段的法律地位。目前，研究較多的快速檢測技術(shù)有酶抑制分光光度技術(shù)[1]、分子印跡技術(shù)[2]、免疫分析技術(shù)等[3]，膽堿酯酶分光光度法檢測有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥具有高效、簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)[1],是國內(nèi)外農(nóng)藥殘留快速檢測的主流技術(shù)[4-5]，在我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管工作中一直發(fā)揮著重要作用。其中使用最為廣泛的是酶抑制-比色法農(nóng)殘速測試劑盒，它包含酶、底物、顯色劑和緩沖溶液等4種試劑，是一種非定量、非定性型的試劑盒[6]。試劑盒中的酶是決定試劑盒質(zhì)量的重要因素，因為不同生物來源的酶在結(jié)構(gòu)上存在一定的差異，而對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥表現(xiàn)出不同的敏感性[1，7]，同一種生物體內(nèi)存在不同的膽堿酯酶形式[8]，這些膽堿酯酶有其不同的特異性底物[8-9]，同時膽堿酯酶對有機(jī)磷農(nóng)藥中的硫代磷酸酯類的農(nóng)藥不敏感導(dǎo)致有機(jī)磷農(nóng)藥的檢出率低[10]，因此不同的商品化試劑盒對不同的農(nóng)藥表現(xiàn)出不同的敏感性[11-13]；同時反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度及緩沖溶液的酸堿度（pH值）等都影響著酶抑制-比色法的檢測結(jié)果[14-15]，薰衣草、小茴香、野生蕨類等很多植物中都含有天然的抑制膽堿酯酶活性的物質(zhì)[16-20]，這些因素會直接或者間接的造成假陽性或者假陰性的檢測結(jié)果，使試劑盒的檢測結(jié)果和樣品的真實(shí)狀況發(fā)生偏差。為了了解商品化的酶抑制-比色法農(nóng)殘速測試劑盒的檢測效果，本研究選用6個品牌市售的酶抑制-比色法快速檢測試劑盒對來源于鄭州市場的韭菜、上海青、山藥等15個果蔬種類的53個蔬菜樣本分別進(jìn)行檢測，同色譜、質(zhì)譜的檢測結(jié)果在不同的判定閾值下進(jìn)行比較，得到每個品牌試劑盒的假陽性率、假陰性率和符合率，同試劑盒對農(nóng)藥的敏感性相結(jié)合[11-13]，旨在選取到優(yōu)質(zhì)的商品化酶抑制-比色法農(nóng)殘速測試劑盒，為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管工作和實(shí)際檢測工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 實(shí)驗儀器CL-BIII型16通道農(nóng)殘速測儀:（上海博納新技術(shù)研究所、上海復(fù)博農(nóng)業(yè)科技有限公司）；WH-861型漩渦混合器（上海康華儀器儀表廠）；HH.W21-Cr 420型電熱恒溫水浴鍋（北京三二八科學(xué)儀器有限公司）；SHA-C型雙重恒溫水浴振蕩器（杰瑞爾電器有限公司）；5 mL、200μL移液槍（美國Thermo公司）；色譜、質(zhì)譜檢測所使用儀器:2010型氣相色譜儀（日本島津公司,配AOC-20i自動進(jìn)樣器、火焰光度檢測器（FPD）和DB-1701色譜柱,30 mm×0.53 mm,0.25μm）；1290-649型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）；Hettic型均質(zhì)機(jī)（德國Heidolph SilentCrusher M公司）；N-EVAPTM-112型氮吹儀（美國Organomation Associates公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

1.1.2 實(shí)驗材料

（1）試劑盒:快速檢測試劑盒為A（深圳）、B（廣州）、C（東莞）、D（廈門）、E（湖北）、F（深圳）。

（2）農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品:乙酰甲胺磷、速滅磷、敵敵畏、二溴磷、敵百蟲、喹硫磷、殺螟硫磷、對氧磷、甲胺磷、磷胺、辛硫磷、甲基嘧啶磷、伐滅磷、甲基毒死蜱、亞胺硫磷、谷硫磷、甲基對硫磷、除線磷、毒死蜱、嘧啶磷、倍硫磷、特丁硫磷、久效磷、地毒磷、乙基溴硫磷、治螟磷、乙硫磷、巴胺磷、吡菌磷、丙溴磷、蠅毒磷、皮蠅磷、對硫磷、甲拌磷、氧樂果、硫環(huán)磷、馬拉硫磷、三唑磷、伏殺硫磷、滅菌磷、乙基谷硫磷、水胺硫磷、二嗪磷、甲基異柳磷、殺蟲畏、苯硫磷、樂果、地蟲磷、乙拌磷、百治磷、異丙威、速滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜、涕滅威、仲丁威、甲萘威、滅多威、3-羥基克百威、克百威（質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)科研檢測所）。

（3）蔬菜樣品:來自鄭州市場。市場檢測員用A或E試劑盒檢測抑制率大于50%的蔬菜樣品。

1.2 試劑配制

1.2.1 試劑盒里試劑的配制各品牌的農(nóng)藥殘留檢測試劑盒里有緩沖鹽、酶、顯色劑和底物，使用前，緩沖鹽用500 mL的蒸餾水溶解，酶、顯色劑和底物分別按照各試劑盒說明書的要求進(jìn)行配制（表1）。

表1 幾個品牌試劑盒中試劑的配制方法和使用量表

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的配制先將1.1.2中所列標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成80μg/mL的儲備液，上機(jī)時將有機(jī)磷類農(nóng)藥分組，稀釋成0.04μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用色譜質(zhì)譜對樣品進(jìn)行檢測比對。

1.3 檢測方法

1.3.1 快速檢測方法將樣品剪成1 cm大小的片或段，混勻后分別稱取樣品2 g，用6個品牌的試劑盒按照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 5009.199-2003蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測）（以下簡稱國標(biāo)）的要求進(jìn)行檢測；每個樣品用每個試劑盒檢測3個平行，檢測后讀出抑制率，取其平均值。

1.3.2 色譜、質(zhì)譜檢測將樣品打漿混勻后稱取25 g樣品按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 761-2008蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定）（以下簡稱行標(biāo)）進(jìn)行前處理，之后分別用氣相色譜火焰光度檢測器FPD）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測定，每個樣品檢測1次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將1.3.1中的速測結(jié)果和色譜質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行比較，計算出假陽性率和假陰性率，按照公式（1）、（2）進(jìn)行計算。

假陽性率（%）=抑制率大于設(shè)定值的樣品數(shù)/色譜、質(zhì)譜60種農(nóng)藥未檢出的樣品數(shù)×100% （1）

假陰性率（%）=抑制率小于設(shè)定值的樣品數(shù)/色譜、質(zhì)譜60種農(nóng)藥檢出的樣品數(shù)×100% （2）

注:公式中的設(shè)定值為一定的抑制率，在表3中指10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%。

2 結(jié)果與分析

2.1 各品牌試劑盒的檢測效果

由表2可知，各品牌試劑盒的檢測結(jié)果同色譜、質(zhì)譜的檢測結(jié)果相比較，都有假陽性和假陰性的檢測結(jié)果產(chǎn)生，按照國標(biāo)[14]50%的判定閾值進(jìn)行統(tǒng)計，出現(xiàn)假陽性的檢測結(jié)果D＞E＞C＞A＞B=F,出現(xiàn)假陰性的檢測結(jié)果則是A＞B=F＞C＞E＞D，同色譜、質(zhì)譜檢測結(jié)果的符合性:D＞B=C=F＞E＞A,最大的符合率為68%，最小的符合率為50.9%；按照行標(biāo)（NY/T 448蔬菜上有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒快速檢測方法）70%的判定閾值進(jìn)行統(tǒng)計，A、C、E試劑盒檢測出現(xiàn)的假陽性樣品大于D、F試劑盒，大于B試劑盒，就假陰性樣品的產(chǎn)生看，A＞F＞B＞C=E＞D；同色譜、質(zhì)譜檢測結(jié)果的符合性:B=C=D＞E＞F＞A，最大的符合率為60%,最小的符合率為34%。由此可見，酶抑制-比色法農(nóng)殘速測試劑盒的檢測效果及其與色譜、質(zhì)譜檢測結(jié)果的符合性不僅與試劑盒中酶的來源有關(guān)，亦和判定閾值的大小有關(guān)。

表2 各品牌試劑盒檢測效果表

2.2 各品牌試劑盒的檢測效果同判定閾值的關(guān)系

2.2.1 假陽性率同判定閾值的關(guān)系由圖1可知，每一種試劑盒檢測樣品的假陽性率都隨著判定閾值的提高而降低。當(dāng)判定閾值設(shè)定為抑制率10%時，F(xiàn)試劑盒檢測的假陽性率最高，為100%，A試劑盒的假陽性率最低，為66.7%；當(dāng)判定閾值設(shè)定為抑制率20%時，B試劑盒檢測的假陽性率最高，為81.8%，C、D試劑盒的假陽性率最低，為63.6%；當(dāng)判定閾值設(shè)定為抑制率30%時，B、F試劑盒檢測的假陽性率最高，為63.6%，A試劑盒的假陽性率最低，為42.9%；當(dāng)判定閾值設(shè)定為抑制率40%時，E試劑盒檢測的假陽性率最高，為71.4%，B試劑盒的假陽性率最低，為18.2%；當(dāng)判定閾值設(shè)定為抑制率50%時，D試劑盒檢測的假陽性率最高，為54.5%，B、F試劑盒的假陽性率最低，為27.3%；當(dāng)判定閾值設(shè)定為抑制率60%時，D試劑盒檢測的假陽性率最高，為54.5%，B試劑盒的假陽性率最低，為9.1%；當(dāng)判定閾值設(shè)定為抑制率70%時，A、C、E試劑盒檢測的假陽性率最高，為27.3%，B試劑盒的假陽性率最低，為9.1%。

圖1 各品牌試劑盒的假陽性率和判定閾值折線圖

由圖2可知，每一種試劑盒檢測樣品的假陰性率都隨著判定閾值的提高而升高。在判定閾值設(shè)定為抑制率10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%時，假陰性率最高的都是A試劑盒，其假陰性率分別為25%、34.4%、50%、53.1%、62.5%、83.9%、87.1%；假陰性最低的均是D試劑盒，其假陰性率分別為0、0、0、7.1%、14.3%、28.6%、42.9%；當(dāng)判定閾值設(shè)定為抑制率10%時，B試劑盒的假陰性率同D相同，也為0；當(dāng)判定閾值設(shè)定為抑制率30%時，B試劑盒檢測的假陰性率同A相同，為50%。

圖2 各品牌試劑盒的假陰性率和判定閾值折線圖

由圖3可知，每一種試劑盒檢測樣品的符合率都未達(dá)到100%；但無論選擇哪種判定閾值，D試劑盒的符合率均最高，在幾個試劑盒中的檢測效果最佳，其他試劑盒的符合率隨著判定閾值的變化稍有波動。

圖3 各品牌試劑盒的符合率和判定閾值折線圖

A試劑盒:其符合率達(dá)到最高（58.5%）時的判定閾值設(shè)定為抑制率10%；其符合率最低（34%）時的判定閾值設(shè)定為抑制率70%；B試劑盒:其符合率達(dá)到最高（64%）的判定閾值設(shè)定為抑制率40%；其符合率最低（44%）時的判定閾值設(shè)定為抑制率30%；C試劑盒:其符合率達(dá)到最高（68%）的判定閾值設(shè)定為抑制率20%或30%；其符合率最低（56%）的判定閾值設(shè)定為抑制率40%；D試劑盒:其符合率達(dá)到最高（76%）的判定閾值設(shè)定為抑制率30%；其符合率最低（64%）的判定閾值設(shè)定為抑制率10%；E試劑盒:其符合率達(dá)到最高（61.5%）的判定閾值設(shè)定為抑制率10%或20%；其符合率最低（46.2%）的判定閾值設(shè)定為抑制率40%；F試劑盒:其符合率達(dá)到最高（60%）的判定閾值設(shè)定為抑制率20%或50%；其符合率最低（44%）的判定閾值設(shè)定為抑制率40%或70%。

3 結(jié)論與討論

總體來看，在參與比對的6個品牌的試劑盒中D試劑盒的檢測效果最佳，也就是說在所設(shè)定的7個判定閾值下，D試劑盒的檢測結(jié)果同色譜、質(zhì)譜的檢測結(jié)果符合率最高。

酶抑制-比色法農(nóng)殘速測試劑盒在日常監(jiān)管中廣泛應(yīng)用，但是由于這種試劑盒既不能定量也不能定性[6]，其測定的是一類或者兩類物質(zhì)的含量總和，在檢測工作中假陽性、假陰性的現(xiàn)象普遍存在，同色譜、質(zhì)譜檢測結(jié)果的符合率各不相同；其符合率同判定閾值之間有一定的關(guān)系，隨著判定閾值的提高假陽性率降低、假陰性率升高，但同色譜、質(zhì)譜檢測結(jié)果的符合性并未持續(xù)升高，每種試劑盒同色譜、質(zhì)譜檢測結(jié)果的符合率都是在一定判定閾值下達(dá)到最高，但6種試劑盒達(dá)到最高的判定閾值各不相同，本研究中當(dāng)判定閾值設(shè)為20%時效果最好，在此閾值下，有3個品牌的試劑盒的檢測效果同色譜、質(zhì)譜檢測結(jié)果的符合率達(dá)到最高，且在參與比對的6個試劑盒中無試劑盒在此判定閾值下出現(xiàn)最低的符合率。因此建議國標(biāo)（GB/T 5009.199-2003蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速檢測）、行標(biāo)（NY/T 448-2001蔬菜上有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒快速檢測方法）對陽性樣品的判定閾值修改為20%。