鹽堿地鹽生植物根際耐鹽促生菌的篩選及鑒定

梁翔宇，顧 欣，劉文輝，孫小涵，白宇馨，馬 艷，李 茜，趙 瑩

（寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021）

鹽堿化是全球耕地土壤面臨的重要問題之一[1]。為了利用鹽堿化耕地并減少土壤鹽堿化程度，人們采用了許多土壤改良方法。其中，生物措施被認為是較為有效且環境友好的措施[2]。例如，使用生物有機肥可顯著改善鹽堿地的土壤性質[3]，施用菌劑可以促進作物在鹽堿化土壤中生長等[4—5]，生物有機肥和菌劑中的耐鹽堿有益功能菌發揮了重要作用[6]。因此，分離獲得耐鹽堿性良好、可促進植物生長的功能微生物對鹽堿地改良及新型菌劑的開發具有重要意義。

根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria,PGPR）是指存在于植物根際周圍的一類可以促進植株生長，提高植株抗病性的微生物[7]。其對植物生長和土壤改良均具有重要作用[8]。針對鹽堿地植物生長和土壤改良需求，耐鹽堿的PGPR逐漸成為研究熱點。有研究者利用三級篩選體系從新疆堿蓬（Suaeda glauca）根際土壤中分離獲得PGPR菌，包括芽孢桿菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌（Staphylococcus sp.）、鹽芽孢桿菌（Halobacillus sp.）、腸桿菌（Enterobacter sp.）和節桿菌（Arthrobacter sp.）[9]；從濱海鹽堿地的非鹽生植物根際土壤中篩選獲得了耐鹽促生芽孢桿菌B.megaterium T1-8菌株和B.paraflexus T4-9菌株[10]；從新疆鹽爪爪（Kalidium foliatum）根際土壤中分離獲得了57株細菌，分屬4個門12個屬，且多數菌株兼有耐鹽和促生作用[11]。以上研究說明，鹽堿地土壤中具有豐富的PGPR資源，有待進一步開發。

銀川平原位于我國西北部，由于氣候、地質和人為干擾等原因，土壤易發生鹽堿化[12]。因此，當地對耐鹽堿PGPR資源的開發和利用存在需求。本實驗通過采集寧夏銀北鹽堿地鹽生植物根際土壤，利用選擇培養法分離篩選耐鹽堿的根際促生細菌，對其進行分類鑒定，并檢測其促生作用和鹽堿耐受性，期望為有益功能菌的開發利用提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土樣采集2019年10月，選擇寧夏銀北地區平羅縣西大灘和惠農區禮和鄉2個鹽堿地區，以堿蓬、鹽爪爪和蘆葦（Phragmites communis）為優勢種的區域，挖取植株，盡量保留根系和根際土壤，裝于密封袋中帶回實驗室。利用抖根法采集植物根際土壤，用于目標微生物的分離篩選。

1.1.2 培養基牛肉膏蛋白胨培養基[13]、阿須貝培養基[14]、解磷菌篩選培養基[15]、解鉀菌篩選培養基[16]、LB培養基[17]、CAS培養基[18]。

1.1.3 主要儀器超凈工作臺（SW-CJ-2FD，上海博迅實業有限公司）；振蕩培養箱（ZD-85，江蘇金壇市醫療器械廠）；恒溫生化培養箱（LRH-250；上海一恒科技有限公司）；顯微鏡（BME，徠卡顯微系統上海貿易有限公司）；高壓滅菌鍋（MLS-3750，SANYO）；電子數顯游標卡尺（LINKS，II型，0～150 mm）；火焰光度計；分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 可培養細菌的分離純化稱取植物根際土壤5 g，置于無菌水95 mL中，于180 r/min、28℃下搖勻30 min，將土壤懸液按梯度進行稀釋后，分別取10-4、10-5、10-6稀釋度的土壤懸液各100μL，采用稀釋涂布平板法涂布于牛肉膏蛋白胨培養基中，倒置于28℃恒溫培養箱，培養24 h。挑取細菌單菌落，經3次劃線純化獲得純培養，接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養基，培養24 h，作為菌種置于4℃冷藏箱中備用。

1.2.2 耐鹽根際促生菌的分離篩選用牛肉膏蛋白胨培養基于28℃活化菌株24 h，轉接至阿須貝培養基上，于28°C培養。定期觀察菌株生長情況，以“+”代表菌株在平板上長出菌落，以示其具有固氮能力。從劃線第2天開始，如果長出菌落記為“+++++”，每延遲1天長出菌落減少1個“+”，連續觀察至第7天，未生長的菌株記為“-”。

將活化后的菌株點接于CAS平板上，每板3個點，每株菌設3個重復，于28℃培養48 h，觀察并記錄有無橙色暈圈，測量單菌落橙色暈圈直徑（D）和菌落直徑（d），每個暈圈和菌落直徑各測量3次取平均值，計算D/d比值。D/d比值小于1記“+”；D/d比值大于1且小于1.5記“++”；D/d比值大于1.5記“+++”。“+”越多代表菌株具有越強的產鐵載體能力，而菌株周圍未產生橙色暈圈的菌株，即不產鐵載體，記為“-”。

菌株的解磷量采用鉬銻抗比色法[19]、解鉀量采用火焰光度法[20]、IAA產量采用Salkowski比色法[21]、ACC脫氨酶活性采用α-酮丁酸法[22]測定。

在牛肉膏蛋白胨培養基中添加NaCl使其質量分數達到5%，6%，7%，8%，9%，共設5個梯度，制成鹽平板。將活化后的菌株依次點接到不同質量分數鹽平板上，每株菌設置3個平板重復，于28℃培養24 h。用游標卡尺測量菌落直徑。每個菌落直徑測量3次，取平均值。菌株能生長的最高鹽分質量分數為該菌株的NaCl耐受值。同理，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液調節牛肉膏蛋白胨培養基pH值，設pH=6、7、8、9、10共5個梯度，制成酸堿度平板，依次點接供試菌株到不同pH值的酸堿度平板上，每株菌設3個重復，于28℃培養24 h后測量菌落直徑。菌株能生長的最高pH值為該菌株的pH耐受值。

1.2.3 數據處理和分析采用Microsoft Excel 2016進行數據處理和圖表制作，采用SPSS 21.0數據處理軟件進行方差分析，采用LSD法在P＜0.05水平上檢測差異性。DNA序列同源性比較使用NCBI系統（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），進化樹的構建采用Mega-X軟件。

1.2.4 耐鹽促生菌的分類鑒定參考《常見細菌系統鑒定手冊》[23]，對目標菌株開展形態學鑒定和生理生化鑒定。活化菌株，提取基因組DNA，對細菌的16 SrRNA基因進行PCR擴增、電泳和回收[24]，委托北京奧維森基因科技公司完成測序。將得到的測序結果提交至Genbank獲得序列號，并在NCBI數據庫中進行BLAST比對，依據對比信息對菌株進行分析鑒定。在數據庫中選擇相近種屬的基因序列，使用Mega-X軟件構建系統進化樹，初步確定菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 菌株的促生活性

共分離獲得細菌83株，其中具有固氮作用的菌株有23株，具有解磷作用的菌株19株，具有解鉀作用的菌株14株，具有產IAA能力的菌株15株，具有產鐵載體能力的菌株11株，具有ACC脫氨酶活性的菌株10株。其中菌株PJ10、PL11、HL3、HJ9和HY5具有2種以上的促生功能，且促生活性較強，如表1所示。經過比較可知，菌株PJ10具有較強的解磷活性，無機磷解磷量為（44.10±0.12）mg/L；菌株PL11和HJ9具有較強的解鉀能力，解鉀量分別為（10.33±0.08）mg/L和（11.01±0.03）mg/L；菌株PL11和HY5具有較強的產IAA能力，分別為（34.01±0.01）mg/L和（32.41±0.08）mg/L；菌株HL3具有較強的固氮能力，但不具有解鉀和產生IAA的能力。

表1 細菌的促生活性

2.2 菌株的鹽堿耐受性

對菌株PJ10、PL11、HL3、HJ9和HY5進行鹽堿耐受性檢測，結果見圖1。在pH=7時，各菌落直徑最大，菌落生長良好。當培養基pH值超過7，各菌落的直徑均呈降低趨勢，但不同菌株的表現存在差異。與pH=7中的菌落直徑比較，pH=8時，HJ9菌落直徑降低了39.55%，其生長能力大幅下降；pH=9時，PL11和HL3的菌落直徑分別下降了8.73%和9.43%，而PJ10和HY5的菌落直徑僅降低了4.24%和4.32%；pH=10時，HJ9不能生長，HL3生長能力下降了54.45%；pH=11時，PJ10、HY5仍具有較好的生長能力，PL11則下降了56.67%。

圖1 不同p H值對菌株生長的影響

由圖2可知，在w（NaCl）=5.00%時，各菌落直徑最大，與其直徑相比，當w（NaCl）=6.00%時，PL11菌落直徑下降了35.58%；w（NaCl）=8.00%時，PL11不能生長，HL3和HJ9的生長能力分別降低了24.02%和36.02%；w（NaCl）=9.00%時，HL3和HJ9的生長能力繼續下降，較w（NaCl）=5.00%時降低了75.55%和55.94%，而HY5和PJ10僅下降了10.10%和11.92%。由此可知，菌株PJ10、HY5、HL3在鹽脅迫和堿脅迫條件下均表現出較好的耐受能力，被確認為目標菌株。

圖2 不同NaCl質量分數對菌株生長的影響

2.3 菌株的分類鑒定

2.3.1 形態學鑒定將菌株PJ10、HL3和HY5于28℃培養24 h，觀察菌落及菌體形態，其特征如圖3所示。

圖3 目標菌株的形態特征

PJ10菌株的菌落較大，呈白色，表面光滑干燥，邊緣整齊，培養基顏色無變化；菌體桿狀，（0.4～0.5）×（0.9～1.0）μm，有芽孢。

HL3菌株的菌落較大，呈白色，表面光滑濕潤，邊緣整齊，培養基顏色無明顯變化；菌體短桿狀，（0.3～0.4）×（0.5～0.8）μm，有芽孢。

HY5菌株的菌落較大，呈白色，表面光滑干燥，邊緣整齊，培養基顏色無變化；菌體桿狀，（0.3～0.4）×（0.7～0.8）μm，有芽孢。

初步判斷3個菌株均為芽孢桿菌屬細菌。

2.3.2 生理生化鑒定由表2可知，3個菌株的生理生化檢測結果符合芽孢桿菌屬細菌的鑒定特征。

表2 目標菌株的生理生化特性

2.3.3 分子生物學鑒定將3株目標菌的基因測序結果錄入NCBI，獲得Genbank編號分別為PJ10菌株MW585077、HL3菌 株 MW585078、HY5菌 株MW585079。各菌株基因序列經BLAST比較并構建系統進化樹。PJ10菌株與壁芽孢桿菌（B.muralis）（MT598008）位于進化樹同一分支，相似性為100%，見圖4。HL3菌株與短小芽孢桿菌（B.pumilus）264-LRN9（MF007158）位于進化樹同一分支，同源性98.66%，見圖5。HY5菌株與萎縮芽孢桿菌（B.atrophaeus）JCM9070（NR_024689）相似性為100%，見圖6。

圖4 菌株PJ10系統發育樹

圖5 菌株HL3系統發育樹

圖6 菌株HY5系統發育樹

3 討論與結論

芽孢桿菌分布廣泛，對鹽堿、高溫等脅迫條件具有一定抵抗能力，常被作為菌種篩選目標[25]。從南通市沿海灘涂鹽堿地中篩選得到的巨大芽孢桿菌（B.megaterium）B7，具有產IAA能力、固氮能力、解磷能力和ACC脫氨酶活性，在w（NaCl）=6%的條件下可正常生長[26]。枯草芽孢桿菌（B.subtilis）JC01具有溶磷和產鐵載體能力[27]。單純芽孢桿菌（B.simplex）SD5具有固氮和解磷作用[28]，但是2株菌的耐鹽堿能力不明。馬氏芽孢桿菌（B.marmarensis）在pH=12、（NaCl）=20%的條件下可正常生長，其在盆栽實驗中表現出較好的促生作用[29]。壁芽孢桿菌HS4具有產IAA能力，耐鹽堿能力不明[30]。短小芽孢桿菌JPVS11具有產IAA能力和ACC脫氨酶活性，且在w（NaCl）=9%的條件下能正常生長[31]。萎縮芽孢桿菌GQJK17S8具有溶磷能力，且在w（NaCl）=10%的條件下能正常生長[32]。這說明芽孢桿菌屬中許多菌株具有促生能力，兼具耐鹽堿能力，是PGPR菌種的重要來源。

芽孢桿菌的耐鹽堿性主要依靠其耐鹽堿基因的表達。如枯草芽孢桿菌的基因組有編碼逆向轉運蛋白的基因mrp。這些逆向轉運蛋白可使微生物在極端鹽堿環境中維持菌體鹽離子平衡和酸堿度穩態，使微生物具備抗鹽堿脅迫的能力[33—34]。蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）的全基因組測序結果顯示，49個基因可能與其耐鹽堿性相關[35]。說明芽孢桿菌耐鹽堿菌株的相關基因資源豐富，對其深入認識有助于鹽堿地的科學利用和抗鹽堿性植物的基因工程育種。

本研究從3種典型鹽生植物的根際土壤中篩選獲得3株PGPR，分別為壁芽孢桿菌PJ10、短小芽孢桿菌HL3和萎縮芽孢桿菌HY5，其分別具有一定的固氮、解磷、解鉀、產IAA、產鐵載體能力和ACC脫氨酶活性，在耐鹽堿性方面表現良好，具有進一步開發利用的價值。

多株PGPR復配的復合型菌劑較單一菌種菌劑對植物的促生效果更強[36—37]。因此，有待對以上3株耐鹽堿PGPR開展復配研究，以明確其最佳復配組合，為新型微生物肥料的開發和利用提供技術支持。