血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平預(yù)測(cè)卵巢癌患者預(yù)后的臨床價(jià)值

裴 培，郭春蓮，高丹鳳

上海市同仁醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200050

卵巢癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，由于位置較深，沒(méi)有特異性的檢測(cè)手段，確診時(shí)70%以上的患者已經(jīng)發(fā)展為晚期，其5年生存率為30%～40%，因此要改善患者的預(yù)后，早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療顯得尤其重要[1-2]。微小RNA(miRNA)是一種轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后均有很重要功能，現(xiàn)有研究證實(shí)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與miRNA的失衡具有重要聯(lián)系[3-4]。現(xiàn)有研究證實(shí)，miR-221-3p參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在卵巢癌患者的血清中出現(xiàn)異常增高[5]，而在腫瘤的臨床病理和預(yù)后方面的研究甚少。miR-451a在多種腫瘤中出現(xiàn)異常表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和遷移具有明顯的抑制作用，同樣發(fā)現(xiàn)在卵巢中出現(xiàn)低表達(dá)[5]，與miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平是否具有內(nèi)在聯(lián)系仍不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)卵巢癌患者血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平，觀察其在卵巢癌預(yù)后中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年12月在本院就診且病理診斷為卵巢癌的患者110例(卵巢癌組)作為研究對(duì)象。卵巢癌患者年齡為45～79歲，平均(61.54±8.65)歲；按照病理類(lèi)型分為漿液性腺癌57例，非漿液性腺癌53例；按照分化程度分為低分化18例、中分化68例和高分化24例；按照國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)(FIGO)分期分為Ⅰ期13例、Ⅱ期35例、Ⅲ期45例和Ⅳ期17例。選取同期在本院經(jīng)病理證實(shí)的良性卵巢腫瘤患者75例作為卵巢良性組，年齡為45～79歲，平均(61.38±6.75)歲。選取同期在本院行體檢的女性健康者45例作為健康對(duì)照組，年齡為45～79歲，平均(60.96±5.81)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)卵巢癌組和卵巢良性組均經(jīng)病理證實(shí)；(2)均為初次就診；(3)所有的患者均未接受放化療；(4)均知情同意，簽署知情同意書(shū)；(5)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患其他惡性腫瘤；(2)患血液性和免疫性疾病；(3)患肝炎、結(jié)核和急慢性肺炎等感染性疾病；(4)患嚴(yán)重的內(nèi)科疾病。各組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1隨訪 所有卵巢癌患者均接受隨訪3年，根據(jù)患者是否死亡分為生存組(79例)和死亡組(31例)。

1.2.2血液標(biāo)本保存和檢測(cè) 卵巢癌組入院后和手術(shù)后1周抽取肘靜脈血2 mL。采用離心機(jī)將血液離心，離心半徑15 cm，離心速度3 000 r/min，離心15 min，抽取上清液放置在除酶管內(nèi)，放置在-70 ℃冰箱中保存。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) (1)總RNA抽取：采集受試者血清400 μL，采用TaqMan miRNA試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄引物由上海化生有限公司合成。miR-221-3p上游引物序列為5′-CCT GAG ATG CAG GGT CCG AGG TAG GTC TA-3′，下游引物序列為5′-TTG CGG ACA TTG CTT GCT A-3′。miR-451a上游引物序列為5′-ATT GCT TGT CTC GGT CTG-3′，下游引物序列為5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG CTT ACA G-3′。U6的上游引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。(2)miRNA檢測(cè)：選擇反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，RNA5 μL和3 μL引物，在15 μL的反應(yīng)體系中，采用美國(guó)ABI TaqMan PreAmp Master Mix進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：16 ℃30 min，42 ℃反應(yīng)30 min和85 ℃反應(yīng)5 min。取反轉(zhuǎn)錄配制20 μL反應(yīng)體系，放置在熒光定量?jī)x中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，連續(xù)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品檢測(cè)3次，以2-ΔΔCt表示。

1.3觀察指標(biāo) 觀察各組血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平的變化，卵巢癌組血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平在術(shù)前和術(shù)后的變化，以及其與臨床指標(biāo)[年齡、腫瘤最大徑、組織分型、分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、糖類(lèi)抗原125(CA125)]和預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1各組血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平比較 卵巢癌組血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平明顯高于卵巢良性組和健康對(duì)照組,而卵巢良性組血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平高于健康對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);卵巢癌組術(shù)后血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平較術(shù)前明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.785，P<0.05)。卵巢癌組血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平較卵巢良性組和健康對(duì)照組明顯降低，而卵巢良性組血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);卵巢癌組術(shù)后血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平較術(shù)前明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.833，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2卵巢癌組血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系 卵巢癌組血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平在不同腫瘤最大徑、分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CA125水平患者間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而在不同年齡和組織分型患者間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 卵巢癌組血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.3卵巢癌患者血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平之間的相關(guān)性 卵巢癌患者血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平與血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.648，P<0.01)。

2.4卵巢癌患者隨訪3年血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系 卵巢癌組術(shù)后隨訪3年，生存組血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平明顯低于死亡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而生存組血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平明顯高于死亡組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 生存組和死亡組血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平比較

2.5聯(lián)合檢測(cè)在預(yù)測(cè)患者3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的效能分析 血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平在預(yù)測(cè)卵巢癌患者3年內(nèi)出現(xiàn)死亡具有較高的效能，根據(jù)患者3年內(nèi)是否出現(xiàn)死亡進(jìn)行Logistics回歸得方程Y=2.46×XmiR-221-3p-2×XmiR-451a-4.49得聯(lián)合檢測(cè)指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)其靈敏度為87.1%，特異度為91.1%，兩者聯(lián)合檢測(cè)的ROC曲線下面積(AUC)為0.929，明顯高于miR-221-3p(Z=2.016，P<0.05)和miR-451a(Z=2.543，P<0.05)單項(xiàng)檢測(cè)的AUC，而血清miR-221-3p和miR-451a的AUC比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表4。

圖1 聯(lián)合檢測(cè)在預(yù)測(cè)卵巢癌患者3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的AUC比較

表4 聯(lián)合檢測(cè)在預(yù)測(cè)患者3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的效能分析

3 討 論

卵巢癌由于位置在盆腔的深部，早期沒(méi)有明顯的癥狀，多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)是晚期，5年存活率較低。卵巢癌患者預(yù)后差的重要因素是早期診斷較為困難，并且化療容易耐藥和容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)。目前診斷卵巢癌的常規(guī)方法主要有經(jīng)陰道超聲、盆腔CT和CA125，但由于這些檢查方法的靈敏度和特異度較低，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)卵巢癌的臨床價(jià)值受限[6]。現(xiàn)越來(lái)越多的研究表明循環(huán)中的miRNA在臨床多種腫瘤的診斷和預(yù)后判斷中具有重要的臨床價(jià)值，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移同樣具有密切相關(guān)性，在卵巢癌診斷和預(yù)后判斷方面同樣具有極高的臨床價(jià)值。

miR-221-3p是一個(gè)重要的促癌基因，在多種腫瘤如宮頸癌、前列腺癌、胃癌和胰腺癌等呈高表達(dá)，且其相對(duì)表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。miR-221-3p通過(guò)靶向THBS2的表達(dá)，促進(jìn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的血管生成，促進(jìn)宮頸癌的遷移和浸潤(rùn)[7]；在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)miR-221-3p促進(jìn)SOX4的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。在胃癌中的研究中表明血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平與腫瘤分期和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在胃癌的預(yù)后預(yù)測(cè)中具有重要臨床價(jià)值[9]；在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，是胰腺癌潛在的生物學(xué)指標(biāo)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌組血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平明顯高于卵巢良性腫瘤組和健康對(duì)照組，卵巢癌組術(shù)后血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平較術(shù)前明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明血清miR-221-3p來(lái)自腫瘤部位，與腫瘤具有密切相關(guān)。有研究顯示miR-221-3p能夠通過(guò)調(diào)節(jié)ARF4靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)內(nèi)皮卵巢癌的增殖和遷移[10]。本研究結(jié)果顯示，血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平在不同腫瘤最大徑、分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CA125水平卵巢癌患者間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平反映卵巢癌的惡性程度和腫瘤的分期，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道結(jié)果類(lèi)似。本研究顯示，當(dāng)血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平>2.73時(shí)，其預(yù)測(cè)3年內(nèi)發(fā)生死亡的靈敏度為77.4%，特異度為84.8%，而AUC為0.859，說(shuō)明血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平在預(yù)測(cè)卵巢癌預(yù)后具有較高的價(jià)值。

miR-451a近年來(lái)研究較多的miRNA之一，與多種腫瘤的生物學(xué)行為具有密切關(guān)系。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)miR-451a能夠通過(guò)干擾YWHAZ基因的表達(dá)，對(duì)FOX03蛋白細(xì)胞核內(nèi)的聚集進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[12]；在胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn)miR-451a能夠作用于CDKN2D和MAP3K1靶基因，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[13]；miR-451a可以通過(guò)干擾CCND2基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)乳腺癌的細(xì)胞凋亡，改善對(duì)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，并發(fā)現(xiàn)miR-451a可以作為乳腺癌預(yù)后的預(yù)測(cè)因子，對(duì)乳腺癌的預(yù)后具有預(yù)測(cè)作用[14]；在另一項(xiàng)研究證實(shí)轉(zhuǎn)染miR-451a后，對(duì)胃癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞株的增殖、分化和轉(zhuǎn)移具有明顯抑制作用，對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用，從而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15-16]。本研究表明卵巢癌患者血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平明顯低于卵巢良性組和健康對(duì)照組，卵巢癌組術(shù)后血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平較術(shù)前明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明miR-451a對(duì)卵巢癌具有保護(hù)作用，是一種抑制基因，與文獻(xiàn)[17]報(bào)道結(jié)果類(lèi)似。本研究結(jié)果顯示，血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平在不同腫瘤最大徑、分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CA125水平卵巢癌患者間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平是卵巢癌的預(yù)后指標(biāo)。隨訪3年發(fā)現(xiàn)，卵巢癌生存組血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平明顯高于死亡組，說(shuō)明血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平與預(yù)后明顯相關(guān)，當(dāng)血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平≤1.43時(shí)，其預(yù)測(cè)3年內(nèi)發(fā)生死亡的靈敏度為96.8%，特異度為73.4%，AUC為0.820，說(shuō)明血清miR-451a相對(duì)表達(dá)水平在預(yù)測(cè)卵巢癌患者3年內(nèi)發(fā)生死亡具有較高的效能。

本研究結(jié)果顯示，卵巢癌患者血清miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平與miR-451a相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，兩者存在某種內(nèi)在聯(lián)系，miR-221-3p作為癌基因?qū)Π┘?xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，而miR-451a基因作為一種抑癌基因抑制腫瘤的生長(zhǎng)，其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測(cè)miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平能夠提高對(duì)卵巢癌患者3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的預(yù)測(cè)效能，其靈敏度高達(dá)87.1%，特異度為91.1%，其AUC明顯高于miR-221-3p和miR-451a單項(xiàng)檢測(cè)，說(shuō)明兩個(gè)指標(biāo)之間存在某種互補(bǔ)性，能夠提高預(yù)測(cè)卵巢癌患者3年內(nèi)發(fā)生死亡的效能，為卵巢癌患者是否采取進(jìn)一步干預(yù)措施提供理論依據(jù)，對(duì)卵巢癌患者術(shù)后適度治療具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

總之，血清miR-221-3p和miR-451a相對(duì)表達(dá)水平在預(yù)測(cè)卵巢癌患者預(yù)后中具有重要的臨床價(jià)值，聯(lián)合檢測(cè)能夠明顯提高預(yù)測(cè)效能。