某病毒標(biāo)本熱滅活處理對血清學(xué)檢驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果的影響*

陳文華，毋崇嶺，鄭 榮，張 玲，高 黝，何寶明

陜西省漢中市中心醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.脊柱外科，陜西漢中 723000

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)傳染力強(qiáng),人群普遍易感,新型冠狀病毒肺炎(COVID-19) 是由SARS-CoV-2感染引起的一種肺部感染性疾病，目前，該病尚無針對特異性治療藥物。國家衛(wèi)生健康委員會將COVID-19納入乙類傳染病,并按甲類傳染病進(jìn)行預(yù)防和控制[1]。由于COVID-19患者血液、體液標(biāo)本具有潛在傳染性,實(shí)驗(yàn)室檢測人員存在職業(yè)暴露可能,給實(shí)驗(yàn)室檢測人員帶來極大的心理壓力和較高的院感防控風(fēng)險(xiǎn)[2]。有研究指出SARS-CoV-2在56 ℃ 30 min處理可被滅活,但標(biāo)本滅活后哪些項(xiàng)目不受影響，哪些項(xiàng)目可以參考使用，哪些項(xiàng)目堅(jiān)決不可以滅活尚不清楚[3-4]。為此，本研究通過對同一患者的兩份標(biāo)本作56 ℃ 30 min熱滅活與未滅活處理后所檢測結(jié)果進(jìn)行分析,旨在探討標(biāo)本經(jīng)56 ℃ 30 min熱滅活處理后，是否對COVID-19診療方案過程中要求的常用監(jiān)測指標(biāo)檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1-12月在陜西省漢中市中心醫(yī)院采用陜西瀏陽三力醫(yī)用科技有限公司的負(fù)壓真空采血管(黃帽管)采集的SARS-CoV-2篩查標(biāo)本95例(每例標(biāo)本均雙管采集，3.0 mL)，標(biāo)本來源于門診、感染科、腫瘤科、內(nèi)風(fēng)濕科等科室。其中男68例，女37例,年齡22～70歲。排除感染性、凝血障礙性等疾病志愿者。

1.2儀器與試劑 日立7180全自動生化分析儀(簡稱日立7180)及廠家配套試劑盒,質(zhì)控品(病理水平和正常水平)為美國伯樂公司生產(chǎn)；德國羅氏有限公司電化學(xué)發(fā)光設(shè)備(簡稱Cobas e801)及廠家配套試劑、質(zhì)控品(陰性和弱陽性質(zhì)控)。歐蒙公司試劑盒，奧林巴斯熒光顯微鏡；重慶博奧賽斯科技生物有限公司磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測設(shè)備(簡稱Axceed 260)及廠家配套試劑、質(zhì)控品(陰性和陽性)；脫帽離心機(jī)型號LXJ-IIC(上海安亭科學(xué)儀器廠)、恒溫水浴箱型號HH-S6(山東博科科學(xué)儀器有限公司)。

1.3標(biāo)本處理 收集95例雙管臨床標(biāo)本，將每例標(biāo)本中的一管室溫放置30 min，作不滅活處理(未滅活組)；另一管置于HH-S6恒溫(56 ℃)水浴箱作熱滅活處理30 min(滅活組)。兩管標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行1 500×g離心10 min,收集上清液，待測。

1.4檢測方法

1.4.1常規(guī)生化項(xiàng)目檢測 在日立7180上同時(shí)對兩組標(biāo)本進(jìn)行丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、尿素(Urea)、肌酐(Crea)、二氧化碳總量(TCO2)、鈣(Ca)、氯(Cl)、膽固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白T(cTnT)、葡萄糖(Glu)和超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)共15個(gè)常規(guī)生化項(xiàng)目檢測。

1.4.2發(fā)光項(xiàng)目檢測 在Cobas e801上采用電化學(xué)發(fā)光法同時(shí)對兩組標(biāo)本進(jìn)行傳染病指標(biāo)[乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗體(HCV-Ab)和艾滋病病毒抗體(HIV-Ab)]、腫瘤標(biāo)志物[甲胎蛋白(AFP)和細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)]、炎癥因子指標(biāo)[降鈣素原(PCT)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)]和甲狀腺激素[促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4)]共10個(gè)發(fā)光項(xiàng)目檢測，檢測結(jié)果以定量形式報(bào)告。

1.4.3自身抗體檢測 采用間接熒光免疫法以手工加樣方式同時(shí)對兩組標(biāo)本進(jìn)行抗核抗體(ANA)和抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)檢測，在奧林巴斯熒光顯微鏡下判讀其核型和滴度的結(jié)果。

1.4.4SARS-CoV-2抗體檢測 在Axceed 260上采用磁微粒化學(xué)發(fā)光法同時(shí)對兩組標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2的IgM和IgG抗體檢測，結(jié)果以S/CO=標(biāo)本發(fā)光值/cut-off表示。標(biāo)本結(jié)果S/CO<1.0判為陰性；結(jié)果S/CO≥1.0判為陽性。以上項(xiàng)目檢測前，其室內(nèi)質(zhì)控均在控。檢測過程嚴(yán)格按照相關(guān)專業(yè)組的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程執(zhí)行，由具有豐富經(jīng)驗(yàn)并考核過關(guān)的人員負(fù)責(zé)操作。

2 結(jié) 果

2.1滅活組和未滅活組常規(guī)生化項(xiàng)目檢測結(jié)果比較 滅活組檢測ALT、ALP、TCO2、CK和CK-MB結(jié)果低于未滅活組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。滅活組檢測TP、Urea、Crea、Ca、Cl、CHOL、TG、cTnT、Glu和hs-CRP結(jié)果與未滅活組檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組常規(guī)生化項(xiàng)目檢測結(jié)果比較

組別nTCO2(mmol/L)Ca(mmol/L)Cl(mmol/L)CHOL(mmol/L)TG(mmol/L)未滅活組9524.57±1.392.18±0.2399.00±11.574.80±0.723.03±0.49滅活組9520.99±1.082.19±0.1998.67±10.384.85±0.693.05±0.54t21.3741.2070.6311.5321.338P0.0070.9720.5640.1410.184

組別nCK(U/L)CK-MB(U/L)cTnT(pg/mL)Glu (mmol/L)hs-CRP(mg/L)未滅活組95219.59±38.2426.39±3.1226.11±4.015.44±1.075.32±0.76滅活組9578.22±10.3710.36±1.4825.98±3.595.18±0.985.17±0.82t32.65831.3210.3870.9271.091P<0.001<0.0011.0000.1090.109

2.2滅活組和未滅活組常規(guī)生化項(xiàng)目相關(guān)性分析 ALT、ALP和CK-MB在滅活組和未滅活組間具有相關(guān)性(r值分別0.997、0.976和0.778，P<0.05)，TCO2和CK在滅活組和未滅活組間無相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

表2 滅活組和未滅活組常規(guī)生化項(xiàng)目相關(guān)性分析

2.3滅活組和未滅活組化學(xué)發(fā)光法檢測項(xiàng)目的結(jié)果比較 滅活組檢測T3、T4和CYFRA21-1結(jié)果低于未滅活組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。滅活組檢測HBsAg、HCV-Ab、HIV-Ab、AFP、PCT、IL-6和TSH結(jié)果與未滅活組檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組化學(xué)發(fā)光法檢測項(xiàng)目的結(jié)果比較

組別nIL-6(pg/mL)TSH(μIU/mL)T3(nmol/L)T4(nmol/L)CYFRA21-1(ng/mL)未滅活組95205.86±77.1412.84±1.021.26±0.4284.78±10.2513.85±1.37滅活組95203.27±79.2512.88±1.391.22±0.3968.02±9.753.02±0.88t0.7051.48523.38721.02516.352P0.6110.0970.0050.0080.012

2.4滅活組和未滅活組自身抗體檢測結(jié)果比較 77例ANA陰性標(biāo)本和77例ANCA陰性標(biāo)本，滅活組和未滅活組均呈陰性結(jié)果，一致性為100%。18例ANA陽性標(biāo)本中，5例核顆粒陽性，6例為核均質(zhì)，3例胞漿顆粒型，2例核點(diǎn)型標(biāo)本，2例核仁型標(biāo)本；18例ANCA陽性標(biāo)本中，11例抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體核周型(pANCA)，7例抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體胞漿型(c-ANCA)。滅活組標(biāo)本熒光核型未發(fā)生改變，熒光強(qiáng)度也未發(fā)生變化。陽性標(biāo)本在滅活處理后結(jié)果均為陽性，陽性結(jié)果符合率為100%，Kappa值=1>0.75，一致性好。見圖1。

注：A未滅活組核均質(zhì)(1∶1 000);B滅活組核均質(zhì)(1∶1 000);C未滅活組核顆粒(1∶320);D滅活組核顆粒(1∶320);E未滅活組pANCA;F滅活組pANCA。

2.5滅活組和未滅活組SARS-CoV-2抗體檢測結(jié)果比較 滅活組和未滅活組SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。95例患者血標(biāo)本中,SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測均陽性的有3例，未滅活組血清SARS-CoV-2 IgM抗體檢出2例陽性，47例陰性；SARS-CoV-2 IgG抗體檢出1例陽性，43例陰性。滅活組血清SARS-CoV-2 IgM抗體檢出2例陽性，46例陰性；SARS-CoV-2 IgG抗體檢出1例陽性，43例陰性。滅活組和未滅活組血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測結(jié)果陰陽性符合率為100%。

表4 兩組SARS-CoV-2抗體檢測結(jié)果比較

3 討 論

SARS-CoV-2感染患者的診斷、鑒別診斷及治療過程中要監(jiān)測常規(guī)生化、傳染病、腫瘤標(biāo)志物、炎癥因子等血清學(xué)指標(biāo)，以及尿液、糞便等體液。如果不作任何處理，就開展相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測，極易因職業(yè)暴露增加醫(yī)護(hù)人員感染風(fēng)險(xiǎn)。除了做好生物安全防護(hù)外,在不影響檢測結(jié)果的前提下,若能在檢測前將標(biāo)本進(jìn)行熱滅活處理,將極大降低醫(yī)務(wù)人員感染的概率。因此,評估臨床標(biāo)本經(jīng)熱滅活處理后是否影響COVID-19診療工作開展就顯得極為重要。

常規(guī)生化檢測項(xiàng)目是疾病監(jiān)測的最常規(guī)的基礎(chǔ)指標(biāo)，是COVID-19診療方案中明確提出的監(jiān)測指標(biāo)[5-6]。本研究對15項(xiàng)常規(guī)生化指標(biāo)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，滅活組TP、Urea、Crea、Ca、Cl、CHOL、TG、cTnT、Glu和hs-CRP檢測結(jié)果與未滅活組檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示可采用56 ℃ 30 min熱滅活方式處理標(biāo)本。滅活組ALT、ALP、CK和CK-MB檢測結(jié)果低于未滅活組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這結(jié)果與劉長德等[7]和郭旺源等[8]學(xué)者的研究結(jié)果一致，認(rèn)為這些酶學(xué)指標(biāo)均為不耐熱酶，56 ℃加熱30 min處理影響了酶的活性。目前臨床標(biāo)本在56 ℃ 30 min熱滅活處理下穩(wěn)定性還存在一定的爭議，還需要更大數(shù)據(jù)的支持。滅活組TCO2檢測結(jié)果低于未滅活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與文獻(xiàn)[9]研究結(jié)果一致。說明加熱可引起血清中CO2丟失,同時(shí)與標(biāo)本采集、運(yùn)輸及上機(jī)時(shí)間也有很大關(guān)系。針對標(biāo)本熱滅活處理后對部分酶學(xué)項(xiàng)目及TCO2檢測的影響，文獻(xiàn)[10]建議對滅活前后的數(shù)據(jù)進(jìn)行直線回歸分析，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，以便于校正后消除影響可參考使用。本研究對上述5個(gè)指標(biāo)回歸分析發(fā)現(xiàn)，ALT、ALP和CK-MB在滅活組和未滅活組間具有相關(guān)性，說明這3個(gè)項(xiàng)目的檢測結(jié)果進(jìn)行校正后可參考使用。但TCO2和CK在滅活組和未滅活組間無相關(guān)性，預(yù)示這兩個(gè)項(xiàng)目的檢測結(jié)果無法進(jìn)行校正后使用。

文獻(xiàn)[11-12]證實(shí)，對疑似或確診COVID-19患者在各項(xiàng)手術(shù)前、侵入性操作前、輸血前均需要對傳染病、腫瘤標(biāo)志物、炎癥因子等檢測，便利于病情監(jiān)測和治療，以及排除其他潛在感染因素，減少醫(yī)務(wù)工作人員的職業(yè)暴露，避免醫(yī)源性感染的發(fā)生。目前，傳染病指標(biāo)、腫瘤標(biāo)志物、炎癥因子等檢測，通常采用免疫反應(yīng)結(jié)合化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)即電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)(ECLIA)進(jìn)行檢測,ECLIA具有檢測速度快、線性范圍寬、特異度強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)。本研究滅活組T3和T4檢測結(jié)果低于未滅活組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與畢東明等[13]研究結(jié)果相一致。這說明熱滅活可能對T3和T4的抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)、蛋白質(zhì)活性或免疫原性產(chǎn)生一定的影響，但目前研究數(shù)據(jù)尚小，還需要多中心大數(shù)據(jù)研究來進(jìn)一步證實(shí)。滅活組CYFRA21-1檢測結(jié)果低于未滅活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與文獻(xiàn)[14]研究結(jié)果相一致。CYFRA21-1是一種可溶性酸性多肽的細(xì)胞角蛋白19的片段,主要出現(xiàn)在肺部，為非小細(xì)胞肺癌的首選生物標(biāo)志物，常常釋放到癌癥患者血清中被檢測出，推測是由于高溫變性導(dǎo)致蛋白或蛋白結(jié)合位點(diǎn)變性,使結(jié)果有顯著差異。滅活組HBsAg、HCV-Ab、HIV-Ab、AFP、PCT、IL-6和TSH檢測結(jié)果與未滅活組檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與孫晶晶等[15]和王輝等[16]研究結(jié)果一致，證明上述指標(biāo)的抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)、蛋白質(zhì)活性或免疫原性不受熱滅活的影響，滅活組和未滅活組該指標(biāo)檢測結(jié)果具有較好的一致性。故在疫情期間用熱滅活處理標(biāo)本不影響這些項(xiàng)目的檢測結(jié)果，可以監(jiān)測病情，從而有效保護(hù)醫(yī)護(hù)工作者。

本研究采用的間接熒光免疫法檢測ANA和ANCA，結(jié)果提示滅活組和未滅活組ANA及ANCA陰陽性符合率、不同滴度、不同核型陰陽性符合率不受影響，但上述研究尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

SARS-CoV-2抗體檢測是COVID-19篩查的重要手段，56 ℃ 30 min熱滅活可以有效避免接觸人員感染SARS-CoV-2。滅活組標(biāo)本采用磁微粒化學(xué)發(fā)光技術(shù)對SARS-CoV-2 2項(xiàng)抗體進(jìn)行檢測是目前重要的檢測方法。本研究對血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，95例標(biāo)本滅活組和未滅活組SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。滅活組和未滅活組血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測結(jié)果陰陽性符合率為100%，與薛雄燕等[17]研究結(jié)果一致，但與劉小政等[18]研究結(jié)果有一定差異，分析其原因可能是方法學(xué)的不同導(dǎo)致的，其研究采用膠體金方法檢測。所以在進(jìn)行標(biāo)本熱滅活處理前除了關(guān)注檢測項(xiàng)目本身、標(biāo)本類型外，還需要關(guān)注同一個(gè)檢測項(xiàng)目的方法學(xué)，以保障檢測質(zhì)量。

檢驗(yàn)科常用項(xiàng)目進(jìn)行56 ℃ 30 min熱滅活，在血清學(xué)項(xiàng)目中常規(guī)生化項(xiàng)目除TCO2、少量不耐熱的酶類ALT、ALP、CK、CK-MB受較大影響外，其他項(xiàng)目均不受影響。發(fā)光檢測項(xiàng)目中傳染病指標(biāo)、腫瘤標(biāo)志物、炎癥因子等不受影響，甲狀腺激素中T3、T4還需要進(jìn)一步加大數(shù)據(jù)驗(yàn)證其是否受熱滅活的影響。自身抗體檢測ANA和ANCA滅活前后核型和熒光強(qiáng)度一致性為100%，SARS-CoV-2抗體檢測的結(jié)果也不受56 ℃ 30 min熱滅活影響。因此，在疫情期間建議對疑似SARS-CoV-2感染患者開展診治時(shí)，應(yīng)對其標(biāo)本進(jìn)行熱滅活處理，以保證檢測結(jié)果質(zhì)量，同時(shí)可降低院內(nèi)感染及防控的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究不足之處：本研究完全模擬日常檢測流程，檢測過程中的隨機(jī)誤差因素未能進(jìn)行有效的控制。同時(shí)由于實(shí)驗(yàn)室的條件限制，因此熱滅活處理的效果降低實(shí)驗(yàn)室檢測生物安全壓力的程度尚不能完全評估。