宏基因組學第二代測序技術在慢性子宮內膜炎患者中的應用分析*

黃高波,彭 芳,李 誠,龔燕飛

岳陽市中心醫院生殖中心，湖南岳陽 414500

慢性子宮內膜炎(CE)是發生在子宮內膜上的慢性炎癥，一般情況下無明顯癥狀，或者伴有輕微的癥狀，病理檢測顯示主要以子宮內膜間質的漿細胞浸潤為特征[1]。研究表明，在婦科疾病中CE的患病率為10%～11%[2]。因CE臨床癥狀表現輕微，容易受到婦科醫生和病理學專家的忽視[3]。在輔助生殖的研究中發現，CE顯著影響患者的胚胎著床，以及后續的胚胎發育，造成反復著床失敗(RIF)或復發性流產(RPL)[4]。研究發現，在RIF或RPL患者中，CE的發病率要顯著高于健康人群[5]。CE診斷基于組織病理學鑒定漿細胞，子宮內膜微生物檢測則能為治療提供客觀、可靠的指導信息[6]。因此，如何能快速、有效地診斷出CE患者的微生物感染類型，在臨床上有著重大意義。

微生物宏基因組學第二代測序(mNGS)，檢測覆蓋范圍大，病毒、細菌、真菌、寄生蟲都能被同時檢測[7]，并且有著較高的靈敏度。在臨床上使用越來越多，如對腦脊液、血液及呼吸道感染部位進行檢測，結果顯示mNGS可提高病原體的陽性率[8-9]。在CE患者中，用mNGS對病原體進行檢測的研究較少。本研究擬探討mNGS在CE患者子宮內膜微生物檢測的有效性，并與傳統的微生物培養進行對比，觀察其對微生物檢測的陽性率及后續對CE患者治愈率的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年12月在本院生殖中心診斷為CE的不孕不育患者共139例作為研究對象。研究對象在進行子宮內膜取樣前均未使用任何抗菌藥物治療。患者年齡22～44歲，平均年齡為(33.05±5.03)歲。研究對象符合CE診斷標準[10]。將139例研究對象隨機分為組1、組2，子宮內膜取樣后進行微生物培養檢測的患者85例作為組1，子宮內膜取樣后進行mNGS檢測的患者54例作為組2。

1.2子宮內膜宮腔取樣

1.2.1通過負壓取樣器吸取宮腔標本 為防止陰道內細菌對標本的影響，清洗外陰后，放置窺陰器，然后用碘伏溶液浸泡紗布擦洗宮頸口，生理鹽水棉拭子擦除宮頸外口黏液。之后用全封閉的負壓取樣器進行內膜取樣,取出的標本密封無菌保存送至實驗室，用于病原體培養或病原體全基因組測序。

1.2.2通過宮腔鏡進行組織取樣 女性在月經期干凈后，接受宮腔鏡探查術后，對子宮內可疑感染組織進行取樣，在進行取樣操作時，為避免陰道內細菌的污染，對外陰清洗后放置窺陰器，之后對宮頸口進行碘伏擦洗消毒。組織取出后不要碰到陰道壁。將標本分為2份，1份用于病原體檢查(病原體培養標本直接送檢，用于mNGS標本放于細胞保存液中，2～8 ℃保存送至實驗室)，另外1份用福爾馬林進行固定，用于病理學檢查和免疫學檢查。

1.3微生物培養 細菌及真菌培養：標本分別接種在巧克力瓊脂平板、麥康凱平板和哥倫比亞血瓊脂平板、沙保羅平板(鄭州安圖公司)，對其實施分區劃線進行接種。在 35 ℃及5%二氧化碳培養箱中進行需氧培養，放入厭氧袋厭氧(法國生物梅里埃)培養，孵育時間為48～72 h。

1.4mNGS

1.4.1標本處理和DNA提取 取子宮內膜活檢標本，超聲破碎后，按照TIANamp Micro DNA kit(DP316，天根生化科技有限公司，中國)試劑盒步驟提取DNA。

1.4.2文庫構建和測序 采用Agilent 2100 Bioanalyzer 質控文庫插入DNA片段，使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(ThermoFisher，美國)按操作說明對DNA文庫濃度進行質控分析，經環化形成單鏈環形結構。環化后的文庫經滾環復制生成DNA納米球(DNB)。制備好的DNB加載到測序芯片，使用BioelectronSeq4000進行測序。測序數據去除低質量和長度小于35 bp的數據以獲得高質量數據，通過比對，將高質量數據中比對上人參考基因組序列的數據去除。去除低復雜度序列后與微生物大數據庫比對，并將比對后的數據按照病毒、細菌、真菌和寄生蟲進行分類排列。

1.5CE治療 確診為CE患者，根據病原微生物的檢測結果進行相對于的治療。如對革蘭陽性細菌感染采用阿莫西林聯合克拉維酸治療，對革蘭陰性細菌感染采用環丙沙星治療，對支原體感染采用交沙霉素治療。而對于病原體檢測陰性的患者采用廣譜抗菌藥物治療，如采用多西環素、甲硝唑和頭孢曲松聯合治療[11]。在治療后的卵泡期，所有患者再次進行宮腔鏡檢查和病理學檢查。如果宮腔鏡和病理學檢查結果均正常，則治療結果，患者判斷為治愈，治療時間不超過3個月。

1.6統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件進行數據分析，數據比對主要采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1組1、組2微生物檢測陽性率比較 組1微生物檢測陽性患者17例，陽性率為20.00%；組2微生物檢測陽性患者43例，陽性率為79.63%，差異有統計學意義(P<0.05)。在本研究中陽性結果表示微生物置信度中度以上，置信度水平由微生物鑒定宏基因組通道技術(MAPMI)內置模型計算得出。高置信度指確定標本中客觀存在檢出物種，如圖1中顯示高度置信金黃色葡萄球菌感染；中置信度指大概率確定標本中客觀存在檢出物種，如圖2中顯示中度置信銅綠假單胞菌感染。疑似結果指不太確定標本中是否存在檢出物種，本研究中不納入陽性結果，如圖3中顯示疑似解脲脲原體感染。

注：本次檢查參考序列來源于金黃色葡萄球菌GCA_000626615.3,標本覆蓋率為84.37%，平均深度為11.0×(測序得到的總堿基數與待測基因組大小的比值)。

注：本次檢查參考序列來源于銅綠假單胞菌GCA_00478465,標本覆蓋率為0.54%，平均深度為1.4×(測序得到的總堿基數與待測基因組大小的比值)。

注：本次檢查參考序列來源于解脲脲原體GCA_000828735.1,標本覆蓋率為0.34%，平均深度為1.1×(測序得到的總堿基數與待測基因組大小的比值)。

2.2組1、組2病原體檢出頻率比較 組1的85例患者中，陽性結果為17例。其檢測出的全部是常見的條件致病菌，如肺炎克雷伯桿菌3例、大腸埃希菌3例、鏈球菌4例、解脲脲原體2例，金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌、人型支原體各1例，未檢出合并感染情況。組2的54例患者中，陽性結果為43例；除了檢測出的常見的條件致病菌外，還檢測出了多例常規培養中不易發現的細菌和病毒，如肺炎克雷伯桿菌6例，大腸埃希菌、鏈球菌、脆弱桿菌各5例，解脲脲原體4例，陰道加德納菌、糞腸球菌、變形桿菌、人型支原體各3例，金黃色葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌、銅綠假單胞菌、普雷沃菌、結核分枝桿菌各2例，檢測出病毒如巨細胞病毒5例、人乳頭狀瘤病毒3例，人型皰疹病毒2例及細環病毒1例。組2中有12例患者同時檢測出了細菌和病毒、支原體。

2.3兩組CE治愈率比較 組1的85例患者中，有44例患者治愈，治愈率為51.76%；組2的54例患者中，有43例患者治愈，治愈率為79.63%。組2的治愈率顯著高于組1，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

在不孕不育的患者中，CE的發病率較高。引起CE的一個主要因素就是微生物感染。研究者們從CE患者子宮內膜中發現了多種不同類型的微生物，有需氧菌、微需氧菌、厭氧菌、支原體、衣原體及病毒等[12-13]。由于微生物的特性及耐藥性的不同，子宮內膜炎患者需要不同的用藥方案進行治療。抗菌藥物的盲目使用會造成人身體內微生物菌群的失調及增加細菌的耐藥性，更不利于胚胎的著床和發育。

因此，如何有效地檢測出女性宮腔內的致病微生物并對其進行治療，在輔助生殖技術中有著非常重大的意義。大多數學者使用微生物培養方法，很少有學者用mNGS技術去研究子宮內膜病原微生物及對CE治愈率的影響。

本研究結果顯示，微生物培養的方法微生物陽性率為20.00%，與文獻[14-15]報道結果相似；mNGS的方法微生物陽性率為79.63%，顯著要高于微生物培養方法。對比了兩組檢出微生物類型，結果顯示微生物培養檢出的微生物主要以常規的條件致病菌為主，如肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌、鏈球菌、支原體等，而在mNGS組中，除了發現了這些常規的條件致病菌外，還發現了較多用常規培養的方法難以檢測的病原體，如脆弱桿菌、普雷沃菌、結核分枝桿菌和病毒等。mNGS檢測在微生物檢測上的應用優勢在于其有著較廣的覆蓋范圍，且能檢測到一些難以發現的病原體。本研究結果中，通過mNGS檢測，顯著提高微生物的陽性率，有效地檢測出多種罕見的病原體和多種病原體混合感染的情況。本研究結果顯示，在治療3個月后，組2的治愈率顯著高于組1，差異有統計學意義(P<0.05)，本研究的治愈率高于文獻[16]的報道結果。

自從mNGS首次被用于臨床病原學診斷后，其應用也越來越廣泛。很多研究結果表明其在特異度無差別的情況下，能顯著提高檢測的靈敏度[17]，很適用于臨床上不明、少見及不典型癥狀的檢測。在本研究中，利用mNGS技術診斷，得到了較好的臨床結局，但是廣泛應用于CE的診斷，仍然存在不少的挑戰。如在采集過程中對無菌操作要求較高；mNGS技術對實驗室要求較高，能開展的實驗室較少；相對于普通的培養和PCR檢測，mNGS花費較高，部分患者難以接受。因此，mNGS雖然能顯著提高CE的微生物檢驗效率，仍然需要更多的研究來提高mNGS在臨床上的可操作性，以及技術上的革新來降低檢測成本。

綜上所述，對于CE患者利用mNGS的方法，能顯著提高患者子宮內膜微生物檢測的陽性率，并且進行針對性的藥物治療后，能顯著提高CE患者的治愈率。雖然目前在臨床全面應用還存在一定困難，但mNGS作為一種新型的微生物檢測手段，對子宮內膜微生物檢測有較大的應用價值和應用前景。