高苯丙氨酸血癥檢測技術聯合應用及家系基因研究*

李雨雨，許 佳，劉 娜，李洪俞，王燕，牟 凱

淄博市婦幼保健院醫學遺傳科，山東淄博 255000

高苯丙氨酸血癥(HPA)是一種常染色體隱性單基因遺傳病，主要分為兩類：一類是由于苯丙氨酸羥化酶(PAH)缺乏導致的苯丙酮尿癥(PKU)和輕度HPA，其中PKU最為常見;另一類是由于PAH的輔酶四氫生物蝶呤缺乏導致的四氫生物蝶呤缺乏癥[1-3]。上述酶的缺陷會導致血液苯丙氨酸(Phe)代謝障礙和旁路毒性代謝產物積累，進而引發智力障礙、發育遲緩、運動失調、黑色素缺乏、癲癇等不同程度且不可逆損傷[4-5]。HPA患兒早期多無明顯的臨床癥狀，不同的疾病類型其診斷和治療方法也不同。因此，不同HPA檢測方法的聯合應用有利于對疾病進行鑒別診斷和對癥治療。我國北方尤其是西北地區HPA發病率普遍高于南方，具有人群和地域差異性[5-6]。大多數HPA患兒是由于PAH基因突變所致，種類多樣，區域分布不同。本研究通過對本院近3年新生兒足跟血Phe篩查情況進行回顧性分析，了解本地區HPA主要檢測技術的聯合應用、發病率及患兒家系基因變異等最新情況，為新生兒遺傳代謝病篩查質量的提高、產前診斷、擴充基因突變譜及遺傳咨詢等提供參考依據。現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年12月在本院進行HPA篩查的128 997例新生兒作為研究對象，新生兒家屬均已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本采集 按照《新生兒遺傳代謝病篩查技術規范》要求，新生兒出生2～7 d并充分哺乳，最遲不超過出生后 20 d，采集足跟血滴于專用濾紙片上。血斑要求至少3個且直徑均大于 8 mm，自然滲透無污染。血斑晾干后于 2～8 ℃冷藏，及時遞送至淄博市醫學遺傳科新生兒疾病篩查中心。

1.2.2檢測方法 熒光法：采用美國Perkin Elmer(PE)公司的全自動P9打孔儀,打取直徑3.2 mm干血片于96孔U型板中，將PE公司的Phe測定試劑和樣品微孔板裝載入全自動免疫熒光分析儀(GSP)進行檢測。串聯質譜法：采用美國 Waters-TQ Detector 串聯質譜儀、Waters 2777c 自動進樣器、Waters 1525高效液相色譜泵，PE公司的非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測定試劑盒進行檢測。打取3.2 mm干血片于96孔U型板中，每孔加入 100 μL 含氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮內標的萃取液，貼上封口膜。然后，45 ℃恒溫振蕩孵育45 min，吸取75 μL至96 孔V型板中，鋁箔紙覆蓋，琥珀酰丙酮衍生2 h后上機檢測。基因檢測：應用基因捕獲配合高通量測序分析技術進行PAH基因檢測，Sanger測序進行結果驗證。

1.3結果判斷 初篩陽性標本立即召回復查，復查結果仍為陽性者通過血串聯質譜、尿氣相-色譜質譜、尿蝶呤譜、紅細胞二氫蝶啶還原酶測定、下一代測序技術(NGS)等相關檢測進行診斷，一旦確診為HPA患兒，由本院專家負責建檔案統一管理，并進行治療與隨訪。除四氫生物蝶呤缺乏癥，按照血Phe濃度可分為經典型PKU(Phe≥1 200 μmol/L)、中度PKU(360～<1 200 μmol/L)、輕度HPA(120～<360 μmol/L)。

1.4質量控制 室內質量控制：每板均做低、高質控品進行質量監測，結果均在允許誤差范圍內發放報告。室間質評，本科室每年都會參加國家衛生健康委臨床檢驗中心和美國疾病控制與預防中心的室間質量評價，成績均合格。

2 結 果

2.1熒光法和串聯質譜法在HPA檢測中的應用 本科室利用GSP熒光法共檢測128 997例新生兒足跟血Phe濃度，其中79 732例同時利用串聯質譜法檢測Phe濃度、Phe/酪氨酸(Tyr)比值和其他10種氨基酸及31種肉堿水平。兩種檢測方法均能有效檢出11例確診HPA患兒，均可用于新生兒HPA的篩查。2019年下半年，由于PE 公司GSP-Phe試劑盒生產工藝改變導致初篩陽性率明顯降低，綜合99.00%百分位數1.75和2018年度初篩陽性率1.10%，將GSP-Phe項目切值由2.00 mg/dL重設定為 1.70 mg/dL，2020年初篩陽性率為1.22%。見表1、2。

表1 2018-2020年Phe濃度百分位數(mg/dL)

表2 2018-2020年新生兒HPA篩查情況

2.22018-2020年新生兒HPA篩查結果分析 魯中地區近3年接受HPA篩查的128 997例新生兒，初次篩查可疑陽性數為1 212例，召回1 135例，召回率為93.65%。HPA最終確診11例，其中PKU 9例，輕度HPA 2例，無四氫生物蝶呤。見表2。

2.3HPA患兒基因家系驗證結果分析 11例HPA確診患兒中有2例進行了高通量測序和Sanger測序變異位點的家系驗證。先證者1 PAH基因檢測出3個雜合變異，根據家系驗證結果表明，明確致病變異c.842+2T>A和意義未明變異c.158G>A均遺傳自父親；意義未明變異c.155T>G遺傳自母親。其父親、母親、姐姐表型均正常，表明c.155T>G基因突變可能具有致病性，與c.842+2T>A致病變異組成PAH基因復合雜合突變，影響PAH基因功能，進而導致先證者1表現PKU。見表3。先證者2 PAH基因檢測出兩個雜合致病變異，致病變異c.728G>A來源于其父親，致病變異c.740G>T來源于其母親。其父親、母親表型均正常，先證者2來源于父母雙方的兩個致病變異組成PAH基因復合雜合突變，進而表現出PKU。見表4。

表3 先證者1 PAH基因變異驗證結果

表4 先證者2 PAH基因變異驗證結果

3 討 論

HPA是一種常見的常染色體隱性遺傳代謝病，可通過檢測新生兒足跟血Phe濃度達到早篩查、早診斷、早治療，避免神經系統等不可逆損傷。常采用的HPA檢測方法有熒光法、串聯質譜法、基因測序等，通過不同檢測方法的聯合應用，使得HPA疾病研究更為透徹深入，更有利于疾病的早期診斷。不同國家和地區HPA發病率不同，具有明顯的人群和地域差異性，了解HPA發病率和分子流行病學特征可為本地區HPA診斷、治療提供參考依據[7-9]。在HPA中PKU發病率較高，輕度HPA較少，PAH基因復合雜合變異或純合變異是PKU重要的致病因素，其中76%PKU患者具有PAH基因復合雜合變異，純和變異較少[10]。目前，國內外數據庫收錄的PAH 基因變異達1 000多種，但其基因型與表型相關性也較為復雜，尚需繼續進行該臨床數據和功能機制的收集與研究[11-12]。

本研究采用熒光法、串聯質譜法檢測新生兒足跟血Phe濃度來進行HPA篩查。不同HPA檢測方法因儀器、實驗原理、試劑工藝和廠家等不同，具有不同的參考范圍。因此，不同地區、不同實驗室應建立并適時調整符合自身的切值范圍，避免HPA患兒的漏篩和假陽性率過高等[13]。2019年下半年，本研究發現因GSP-Phe試劑盒生產工藝改變，初篩陽性率明顯降低。綜合分析后將切值由2.00 mg/dL重設定為 1.70 mg/dL，同時利用串聯質譜法檢測近期Phe濃度處于臨界范圍的標本，未發現患兒漏篩。本地區近3年HPA確診患兒11例，發病率與文獻[3,14]結果基本一致，高于文獻[15]的結果。其中2例PKU患兒通過基因檢測和家系驗證結果發現：PAH基因變異為復合雜合變異；PAH致病變異c.842+2T>A,c.728G>A,c.740G>T和意義未明變異c.158G>A在中國比較常見[16]；PAH c.155T>G變異為新發變異，文獻鮮少報道。家系驗證結果表明PAH c.155T>G很可能具有致病性，這對于生化表型不明顯患者、疾病鑒別診斷、再生育的遺傳咨詢等具有重要意義，有利于豐富PKU基因型和表型相關性數據庫。本研究不足之處在于家系分析標本較少，應加大HPA確診患兒家系驗證標本量，明確致病基因變異，提高遺傳咨詢、出生缺陷防控能力。

隨著分子檢測技術的發展，NGS在新生兒遺傳代謝病中的應用越來越廣泛，對于生化檢測和串聯質譜不能明確分型、不能篩查的疾病更具優勢[17]。但是，NGS中的靶基因測序和全外顯子測序可檢出大量基因突變位點，報告解讀需結合生化和串聯質譜等檢測結果，綜合分析基因型和表型相關性。尤其對于致病突變不明確的，通過基因檢測其家系基因變異情況，更有利于疾病的追根溯源，實現早診斷、早治療。

本項目創新之處在于探討了HPA檢測技術的聯合應用及其存在的相關問題，以及家系基因的發現和新發變異PAH c.155T>G為致病變異。目前，有研究報道中國人群中有100多種PAH基因變異，但未發現此類型變異[18-19]。通過不斷累積PAH新發變異，可進一步擴充PAH基因變異及致病性的數據量，有助于分子診斷報告的解讀。

綜上所述，本研究系統分析了近3年HPA篩查應用情況，熒光法、串聯質譜法、分子檢測相結合將是本地區新生兒HPA篩查的有效策略。綜合分析HPA發病率、家系基因驗證等最近相關數據，可進一步為新生兒遺傳代謝病篩查、診治和遺傳咨詢等提供相關參考依據。