基于網絡藥理學分析四君子湯治療結直腸癌的作用機制

葛韻芝，許 寅，丁 超

上海市公共衛生臨床中心,上海 201508

結直腸癌是男性癌癥死亡的第三和女性癌癥死亡的第二大原因［1-3］。由于該病病程隱匿，在臨床上，大多數結直腸癌患者直到Ⅱ～Ⅲ期才得到確診［1］，這使得結直腸癌難以在早期被干預。因此，手術與藥物化療仍然在結直腸癌治療中發揮重要作用［4］。近年來，結直腸癌患者的五年生存率未見明顯提升［5］。目前，研究表明，中藥單用或聯合化療藥物可以改善結直腸癌患者生存與生活質量［6］。四君子湯，見于宋代《太平惠民和劑局方》，用于脾胃氣虛證，近年來常被用于結直腸癌的臨床治療［7-9］。作為補氣健脾的經典方，由人參、白術、茯苓、甘草組成。研究表明，其能改善結直腸癌患者血清血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）與酸性成纖維生長因子（acid fibroblast growth factor，aFGF）水平［8］；影響結腸癌細胞超微結構和端粒長度［10］；改善結腸癌患者細胞凋亡及腸道屏障恢復情況［11］。然而，由于中藥復方成分復雜，四君子湯對結直腸癌療效的分子機制尚不清楚。

作為中醫研究的新領域，網絡藥理學可以通過使用建立中藥復方化合物靶標網絡并進行網絡拓撲分析等手段從系統的角度闡明中醫藥的作用機制［12-13］。在本研究中，我們通過網絡藥理學網絡拓撲分析、富集分析及魯棒性分析等方法對四君子湯治療結直腸癌的潛在作用機制進行了研究，為其臨床應用與藥物開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP）、中醫藥資料庫（traditional Chinese medicine database，TCM database@Taiwan）、中醫綜合數據庫（traditional Chinese medicine integrative database ，TCMID）、中藥潛在靶點預測平臺（traditional Chinese medicine potential target database，TCMPTD）與草藥成分和靶點數據庫（herbal ingredients'targets database，HIT）用于中藥復方四君子湯的化合物與靶標收集，數據納入條件為生物利用度（oral bioavailability，OB）大于30% 及類藥性（druglikeness，DL）大于0.18；OMIM 數據庫、DisgeneT 數據庫與GeneCard 數據庫用于結直腸癌靶標收集，數據納入關鍵詞為結直腸癌；String數據庫用于分析蛋白質-蛋白質互相作用（proteinprotein interaction，PPI），篩選分數為0.850；Reactome 數據庫、Omicsbean數據庫和DAVID數據庫用于進行KEGG和GO（gene ontology）富集分析，納入標準為P＜0.05；Cytoscape 3.2.1 軟件用于四君子湯化合物-靶標網絡構建及網絡拓撲參數分析。數據庫及軟件信息見表1。

表1 數據庫及軟件信息

1.2 四君子湯化合物-靶標網絡構建及網絡藥理學分析使用Venn 分析工具選取四君子湯與結直腸癌的共同靶標。使用“Cytoscape 3.2.1”軟件構建四君子湯治療結直腸癌的化合物-靶標網絡。使用“Cytoscape 3.2.1”軟件中的Network Analyzer 工具對該化合物-靶標網絡進行分析，導出并計算網絡中各個節點的相關拓撲參數，包括：節點度（degree）、介數中心性（betweenness centrality）、緊密中心性（closeness centrality）以及拓撲系數（topological coefficient）。依據SHI［14］等人的方法，使用Venn 分析工具選取并保留4種參數皆在前50%的節點。

1.3 四君子湯化合物-靶標核心網絡構建及富集分析用“Cytoscape 3.2.1”軟件將“1.2”項中保留的節點進行四君子湯化合物-靶標核心網絡的構建。將化合物所關聯的靶標進行京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本體（gene Ontology，GO）富集分析。

1.4 四君子湯化合物-靶標核心網絡構建中化合物貢獻分析在四君子湯化合物-靶標核心網絡中將不同化合物敲除，通過“Cytoscape 3.2.1”軟件中的“Network Analyzer”工具，使用LIU［15］等的方法對化合物敲除后的四君子湯化合物-靶標核心網絡進行魯棒性R 值分析。將化合物以魯棒性R 值排序，評估化合物在網絡中的貢獻程度以選取四君子湯治療結直腸癌的潛在關鍵化合物并分析四君子湯的潛在作用機制。

1.5 四君子湯治療結直腸癌的潛在關鍵化合物分析及通路比較將“1.4”項中得到的關鍵化合物所關聯的靶標進行KEGG 和GO 富集分析。將關鍵化合物的信號通路及生物功能與四君子湯的信號通路及生物功能進行比較，分析預測四君子湯治療結、直腸癌的潛在關鍵化合物組合及四君子湯的潛在作用機制。

2 結果

2.1 化合物靶標收集及四君子湯化合物-靶標網絡通過數據庫檢索及Venn 分析工具，共搜集四君子湯中化合物217個、四君子湯化合物靶標305個和結直腸癌靶標1349 個。建立四君子湯化合物-靶標網絡，該網絡包括四君子湯化合物119個、四君子湯與結直腸癌的共同靶標156 個。該網絡含275 個節點與1716 條邊，平均節點度為12.85，其中化合物平均節點度為15.84，靶標平均節點度為10.79。見圖1。

圖1 四君子湯化合物-靶標網絡

2.2 四君子湯化合物-靶標核心網絡如圖2A所示，使用Venn 分析工具對化合物-靶標網絡中節點的節點度、介數中心性、緊密中心性及拓撲系數進行分析，共保留4 種參數皆在前50% 的節點40 個。如圖2B 所示，建立四君子湯化合物-靶標核心網絡，該網絡包括四君子湯化合物7 個、核心靶標33 個。該網絡含40 個節點與70 條邊，平均節點度為4.24，其中化合物平均節點度為10，靶標平均節點度為2.69。七種化合物分別為高麗槐素、羅通定、山萘酚、常春藤皂苷元、β-谷甾醇、豆甾醇與人參皂苷rh2。使用Omicsbean和DAVID工具對該網絡中的四君子湯治療結直腸癌核心靶標進行KEGG 及GO 的富集分析，保留排名前10 的條目，結果見圖3。四君子湯治療結直腸癌核心靶標富集分析結果分為信號通路分析、生物進程分析、分子功能分析與細胞組分分析，其中得到的主要信號通路有PI3K-Akt 信號通路、雌激素信號通路及VEGF 信號通路等；主要生物進程有對含氧化合物的反應、對細胞進程的調控及對脂質的反應等；主要分子功能包括蛋白質二聚化活性、酶結合與蛋白質結合等；主要細胞組分有膜區響應、神經元投射及細胞投射等。

圖2 網絡拓撲參數分析

2.3 四君子湯治療結直腸癌核心化合物分析使用魯棒性R值評價，敲除7種化合物對四君子湯化合物-靶標核心網絡穩定性的影響，并進行排序，見表2。選取對網絡穩定性影響較高的4 種化合物進入后續分析，指示其對四君子湯化合物-靶標核心網絡的穩定性貢獻最大。見圖3。4 種化合物為高麗槐素、羅通定、山萘酚和常春藤皂苷元。4 種化合物及其靶標分別治療結直腸的化合物-靶標網絡見圖4。

圖4 4種化合物治療結直腸癌的化合物-靶標網絡

表2 7種化合物對網絡穩定性的影響

圖3 四君子湯治療結直腸癌核心靶標富集分析結果

2.4 四君子湯治療結直腸癌的藥理機制預測4種化合物與四君子湯治療結直腸癌的共有信號通路、生物進程、分子功能與細胞組分見圖5。主要共有信號通路包括PI3K-Akt 信號通路、cGMP-PKG信號通路及PPAR 信號通路；主要共有分子功能有藥物結合；主要細胞組分有質膜區響應與神經元影響。4 種化合物與四君子湯治療結直腸癌的潛在信號傳導途徑與藥理機制預測見圖6。我們預測四君子湯及其核心化合物高麗槐素、羅通定、山萘酚與常春藤皂苷元能夠通過調節PI3K-Akt 信號通路、cGMP-PKG 信號通路及PPAR 信號通路影響生物體脂代謝、細胞生存、細胞周期及細胞凋亡進而參與結直腸癌的治療。

圖5 4種化合物與四君子湯治療結直腸癌的共同富集分析結果

圖6 4種化合物與四君子湯治療結直腸癌的潛在信號傳導途徑與藥理機制預測

3 討論

由于結直腸癌病理機制復雜且治療困難，針對結直腸癌的藥物開發目前仍然未見突破［5］。而傳統中醫藥理論注重整體理論，通過對多靶點的干預改善疾病的進程，因此中醫藥在治療復雜疾病方面具有一定優勢［16-17］。在藥物開發中，網絡藥理學方法能夠同時基于化學與生物信息對藥物與機體的互相作用進行探討［18］。網絡藥理學和中醫藥理論的整體觀念具有共同點，能夠系統地分析中藥復方改善復雜疾病中人體功能網絡失衡的作用機制［19］。近年來，中藥復方已經越來越多地參與到結直腸癌的治療中［8-11］。

在本研究中，我們基于網絡藥理學方法分析了四君子湯治療結直腸癌的藥理機制。評估節點的網絡拓撲參數進而衡量其在網絡中的重要性是常用的網絡藥理學研究手段［14］。通過建立四君子湯化合物-靶標網絡并使用拓撲參數篩選方法進行網絡優化，我們建立了四君子湯化合物-靶標核心網絡。該網絡包括7個化合物以及33個靶標，7個化合物分別為高麗槐素、羅通定、山萘酚、常春藤皂苷元、β-谷甾醇、豆甾醇與人參皂苷rh2，其中山萘酚被報道能夠抑制肺癌細胞的增殖與遷移［20］，常春藤皂苷元與豆甾醇能夠誘導腫瘤細胞凋亡［21-22］。使用富集分析工具發現四君子湯治療結直腸癌的潛在主要信號通路為PI3K-Akt 信號通路、雌激素信號通路、cGMP-PKG 信號通路及PPAR信號通路及VEGF信號通路等，其中PI3K-Akt信號通路與結直腸癌直接相關［23］，雌激素信號通路可以通過影響G 蛋白偶聯雌激素受體增加結直腸癌的增殖［24］，cGMP-PKG 信號通路與結直腸癌患者生存相關［25］，PPAR 信號通路能夠靶向FABP4 促進結直腸癌細胞的侵襲和遷移［26］，VEGF 信號通路能夠直接影響結直腸癌的耐藥性［27］。該結果提示，在四君子湯中，7 種化合物可能通過影響以上信號通路對結直腸癌的治療產生影響。

魯棒性是指生物信息網絡在受到內外干擾的情況下維持其網絡穩定性的能力，魯棒性越高表示網絡越穩定［28］。在生物信息網絡中，通過加入或敲除靶標引起的網絡擾動已經被認為是探討靶標重要性的關鍵。在網絡藥理學研究中，網絡穩定性考察已經是一種常用的研究方法［15，29］。在本研究中，我們將7 種化合物的關聯靶標在四君子湯化合物-靶標核心網絡進行分別敲除，進而使用魯棒性評估7 種化合物對四君子湯化合物-靶標核心網絡的貢獻大小。通過篩選，我們保留了高麗槐素、羅通定、山萘酚和常春藤皂苷元4 種化合物，提示這4 種化合物可能是四君子湯治療結直腸癌的潛在有效化合物。通過建立4 種化合物的網絡并與四君子湯治療結直腸癌進行富集分析對比，我們發現4 種化合物與四君子湯治療結直腸癌的信號通路在PI3K-Akt 信號通路、cGMP-PKG 信號通路及PPAR 信號通路上高度重合；同時，藥物結合、質膜區響應與神經元影響等生物進程、分子功能與細胞組分也被四君子湯和4 種化合物靶標的共同富集，其中，藥物結合被報道與結直腸癌中藥物靶點直接相關［30］，腸神經元在結直腸癌的發生發展中發揮著重要作用［31］，質膜區響應與結腸直腸腺瘤檢測有關［32］。該結果提示PI3K-Akt 信號通路、cGMP-PKG 信號通路及PPAR 信號通路可能是四君子湯治療結直腸癌的潛在作用機制；藥物結合、質膜區響應與腸神經元影響可能是四君子湯治療結直腸癌的潛在物質基礎。

在癌癥治療中，化合物對信號通路以及物質基礎的影響最終會影響生物功能及進程［33］。在網絡藥理學研究中，通過建立化合物-靶標作用網絡可以進行化合物潛在作用機制的預測［34］。在本研究中，我們對四君子湯治療結直腸癌的潛在信號傳導途徑進行了預測。PPAR 信號通路能夠影響機體的脂代謝［35］與細胞生存［36］；PI3K-Akt 信號通路直接參與生物體內的脂代謝［37］、細胞生存［38］、細胞周期［39］及細胞凋亡［40］；cGMP-PKG 信號通路則與細胞的增殖以及凋亡密切相關［41］；同時，藥物結合能夠影響腫瘤細胞凋亡［42］，質膜區響應是細胞周期改變中的重要環節［43］，腸神經元改變通過影響細胞周期與凋亡進程促進結直腸癌的發生發展［31］。本研究中，我們預測中藥復方四君子湯中的高麗槐素、羅通定、山萘酚和常春藤皂苷元可能通過調控PI3K-Akt、cGMP-PKG與PPAR信號通路以及藥物結合、質膜區響應與神經元影響等生物功能進而影響機體內的脂代謝、細胞生存、細胞周期和細胞凋亡進程，從而發揮對結直腸癌的治療作用；其中，山萘酚并未影響cGMP-PKG 信號通路。該結果提示四君子湯以及其中的化合物高麗槐素、羅通定、山萘酚和常春藤皂苷元能夠多靶點多通路地通過協同作用影響結直腸癌治療；四君子湯治療結直腸癌的潛在作用機制與調控PI3KAkt、cGMP-PKG 與PPAR 信號通路并影響下游生物功能密切相關。

在本研究中，通過網絡藥理學方法，我們預測四君子湯治療結直腸癌的作用機制可能主要集中在7 種化合物與33 個靶標上；高麗槐素、羅通定、山萘酚和常春藤皂苷元可能是四君子湯治療結直腸癌的關鍵化合物；四君子湯治療結直腸癌的潛在作用機制與調控PI3K-Akt、cGMP-PKG和PPAR信號通路以及藥物結合、質膜區響應和腸神經元進而影響脂代謝、細胞生存、細胞周期與細胞凋亡有關。該研究能夠為四君子湯改善結直腸癌的臨床治療及藥物開發提供思路與物質基礎。然而，四君子湯治療結直腸癌的作用機制仍未徹底明晰。在未來的研究中，我們將使用體內外藥理學驗證的方法，對本研究中的網絡藥理學預測結果進行驗證并考察4 種化合物在結直腸癌治療中的協同作用。