響應面法優化四妙勇安湯菌質固態發酵工藝?

馬新換，李季文，畢映燕，王雪梅

甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

四妙勇安湯的處方最先記錄于華佗的《神醫秘傳》，曰“此疾發于手指或足恥之端，先疹然后痛，甲現玄色，久則潰敗，節節脫落……內服藥用玄參三兩，金銀花三兩，當歸二兩，甘草一兩，水煎服。”清朝醫家鮑相敖將此方命名為“四妙勇安湯”，收載于《驗方新編》中，并稱其醫治脫疽“連續十劑，永無后患”［1］。目前臨床上不僅僅用四妙勇安治外科脫疽，其在周圍血管病科、骨科、眼科也廣泛應用［2-9］。真菌發酵可以富集中藥成分，不僅可減少藥材用量，還可提高療效［10］。筆者通過查閱相關資料發現，利用藥用真菌進行中藥發酵亦可組成中藥復方，通過其分解轉化能力，提高中藥中活性成分的單位濃度，且可產生新的活性物質，獲取更多的有效成分，共同作用于機體，發揮整體效應［11-13］。本文通過真菌發酵技術，對四妙勇安湯方進行發酵研究，以期實現減少服用量，提高臨床療效的目的。通過本研究初步建立四妙勇安湯方菌質真菌發酵工藝條件，旨在為四妙勇安湯的開發研究提供試驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器儀器YX280A 型手提式不銹鋼蒸汽消毒器（上海三申醫療器械有限公司）；SB-5200DTS雙頻超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH-S4 型恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司）；MJX-160 型培養箱（寧波江南儀器廠）；HXGZ-000800 電熱恒溫干燥箱（連云港醫療器械設備廠）；BS110 電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 材料真菌菌種由甘肅省中醫院科研制劑中心研發部自制。金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb. 的干燥花蕾或帶初開的花；玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensisHemsl.的干燥根；當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根；甘草為豆科植物脹果甘草Glycyrrhiza inflataBat. 的干燥根和根莖；均由甘肅省中醫院科研制劑中心提供，由甘肅省中醫院主任中藥師李喜香鑒定。

2 方法與結果

2.1 發酵方法

2.1.1 菌種培養將真菌菌種接入121℃、滅菌30 min 的四妙勇安湯方藥材培養基中，于25℃下恒溫培養15天待菌絲體達到發酵終點，即得。

2.1.2 菌質的制備取金銀花、玄參、當歸、甘草飲片，破碎，加入適量的蒸餾水，混合均勻，置于100 mL 試管內，蓋上棉塞，用包裝紙包好，121℃，滅菌30 min。在無菌室內，取制備好的固體種子適量平鋪接種到固體培養基中，在適宜的溫度、濕度下，培養，至發酵瓶底布滿菌絲，即得。

2.1.3 菌絲體生長速度以S 代表每天菌絲生長速度（mm），以菌絲體布滿菌質表面開始計算，平行3 份（A1、A2、A3），將發酵瓶圓形面平均分成4 份，分別測定菌絲體生長速度（S1、S2、S3、S4）。計算公式為：

2.2 單因素實驗

2.2.1 藥材粒徑對菌絲體生長的影響按處方比例分別稱飲片適量，按照飲片、10目、24目、50目、60 目的要求混合，按“2.1.2”項下方法制備菌質，菌質裝至同一高度，菌質條件為含水量為120%，接種量為10%，在27℃，發酵15天。考察不同粒徑對菌絲體生長速度的影響。隨著目數的增加菌絲體生長速度減慢，結果顯示10 目培養基菌絲生長速度快。因此，實驗設計中藥材粒徑選為10目。

2.2.2 發酵時間對菌絲體生長的影響按處方比例分別稱飲片適量，按照5、10、15、20、30 天的要求培養，按“2.1.2”項下方法制備菌質，菌質條件為菌質粒徑為10 目，含水量為120%，接種量為10%，在27℃，發酵不同天數。考察發酵時間，結果顯示15天為最佳發酵時間。

2.2.3 發酵溫度對菌絲體生長的影響按處方比例分別稱飲片適量，按照20、22、24、26、8℃的要求進行培養，按“2.1.2”項下方法制備菌質，菌質條件為菌質粒徑為10 目，含水量為120%，接種量為10%，在按照不同溫度，發酵15天。考察發酵溫度對菌絲生長的影響，結果顯示24℃為最佳發酵溫度。

2.2.4 菌質初始含水量對菌絲體生長的影響按處方比例分別稱飲片適量，按照初始含水量90%、100%、110%、120%、130% 的要求進行培養，按“2.1.2”項下方法制備菌質，菌質條件為菌質粒徑為10 目，接種量為10%，發酵溫度為24℃，在按照不同初始含水量，發酵15 天。考察初始含水量對菌絲生長的影響，結果顯示100% 為最佳初始含水量。

2.2.5 接種量對菌絲體生長的影響按處方比例分別稱飲片適量，按照5%、7%、9%、10%、15% 的接種量要求進行接種培養，按“2.1.2”項下方法制備菌質，菌質條件為菌質粒徑為10 目，初始含水量為100%，發酵溫度為26℃，在按照不同接種量，發酵15 天。考察初始含水量對菌絲生長的影響，結果顯示10%為最佳接種量。

2.3 星點設計-響應面法[14-21]

2.3.1 試驗設計與結果根據單因素實驗結果，本實驗主要研究初始含水量（A）、發酵溫度（B）、接種量（C）3 個因素對響應值菌絲生長速度（S）的影響。采用星點設計分析方法，優化工藝條件，并進行預測實驗分析。因素水平見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 因素水平表

2.3.2 模型建立及回歸分析采用Design Expert 8.0.6軟件，對表2數據進行回歸擬合，得回歸方程為S=11.02+0.67A+1.39B+2.27C+1.18AB+0.98AC+0.94BC-2.23A2-1.44B2-0.13C2，相關系數R2=0.8169，表明方程擬合情況良好。方差分析見表3。式中S 為菌絲體生長速度（mm），A 初始含水量（%）、B發酵溫度（℃）、C接種量（g）。見表3。

表2 菌絲生長速度

從表3 可以看出，模型的P＜0.01，說明該模型得到的回歸方程有高度顯著性差異，試驗設計可靠，模型相關系數R2=0.8169，進一步說明模型具有較好的可信度。在所選取的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序，接種量＞發酵溫度＞初始含水量。方差分析的結果表明方程的總模型、發酵溫度（B）及接種量（C）對菌絲生長速度的影響有顯著性；初始含水量（A）對菌絲生長速度無影響，而交互項AB、AC、BC 對菌絲生長速度的影響不顯著。

表3 回歸方程的方差分析表

2.3.3 效應面分析響應面優化法即是將實驗得出的數據結果進行響應面分析，得到的預測模型一般是個曲面，即所獲得的預測模型是連續的。其優勢是在實驗條件尋優過程中，可以連續的對實驗的各個水平進行分析。

2.4 條件優化、預測與驗證由圖1—3 響應面可知該模型有穩定點，且穩定點是最大值。利用Point Prediction 進行預測分析，獲得一組響應值最大的優化條件：初始含水量124.5%，發酵溫度為28℃，接種量為10%，在此優化條件下，菌絲生長速度S 為14.94 mm。為了方便實際加水量操作，將發酵工藝參數適當調整為：初始含水量125%，發酵溫度為28℃，接種量為10%。在此條件下進行發酵，依法測定菌絲生長速度，對修正結果進行驗證，結果菌絲生長速度為14.66 mm（n=3）。預測值與實際值之間偏差不大，說明該工藝參數在菌芪菌質發酵工藝中具有可靠性和重現性。

圖1 初始含水量和發酵溫度對菌絲生長速度的等高線及響應面圖

圖2 初始含水量和接種量對菌絲生長速度的等高線及響應面圖

圖3 發酵溫度和接種量對對菌絲生長速度的等高線及響應面圖

3 討論

本試驗在研究過程中，通過預實驗，明確中藥菌質的粒徑，并將其粒徑確定為10 目，均值太粗，達到發酵終點的時間太長，菌質太細不利于后續的提取。故在確定菌質粒徑的前提下，經過發酵天數的觀察，明確了發酵15 天可達到發酵終。本試驗應用菌株具有分解纖維素、蛋白質、淀粉等成分的作用，在該試驗研究過程中有利于富集四妙勇安湯方中的有效成分，在臨床使用中減少服用量，同時提高療效。本試驗以四妙勇安湯方藥材為菌質對其進行雙向固態發酵工藝研究，星點設計-響應面法優化條件結果表明，初始含水量（A）及接種量（C）對菌絲生長速度的影響有顯著性；發酵溫度（B）對菌絲生長速度無影響，預測值與實際值之間偏差不大，說明該工藝參數在四妙勇安湯菌質發酵工藝中具有可行性。