基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討杜仲-牛膝治療股骨頭壞死的分子機(jī)制

溫明韜，梁學(xué)振，許 波，劉金豹，楊振勛，李 剛

山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）又稱股骨頭無(wú)菌性壞死（aseptic necrosis，AN）、股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis，AVN），指由于各種原因引起的股骨頭血液循環(huán)障礙，導(dǎo)致股骨頭的周?chē)M織壞死病變進(jìn)而發(fā)展為股骨頭塌陷的一類常見(jiàn)骨科疾病。其主要臨床表現(xiàn)為患側(cè)髖部疼痛、髖關(guān)節(jié)功能障礙［1］，如未得到有效治療，大部分患者會(huì)發(fā)展至股骨頭塌陷而造成髖關(guān)節(jié)功能受限，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量并且?guī)?lái)沉重的生活負(fù)擔(dān)。該病屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“骨蝕”“骨痹”等范疇。《素問(wèn)》曾有“腎者水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”的記載［2］。中醫(yī)治則以補(bǔ)腎活血為治療重點(diǎn)。“杜仲-牛膝”作為中醫(yī)藥治療ONFH 的常用配伍藥對(duì)，二者歸肝、腎經(jīng)，均可活血通經(jīng)、補(bǔ)益肝腎。在應(yīng)用于臨床治療ONFH 的長(zhǎng)時(shí)間過(guò)程中，取得了較為滿意的臨床療效。但由于中藥成分相對(duì)復(fù)雜，相關(guān)中藥藥效學(xué)分析及毒理機(jī)制研究不足，有效活性成分及作用機(jī)制缺乏準(zhǔn)確可靠的研究結(jié)果支撐。網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)分析、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)理論的建立，為研究中藥潛在活性成分和作用靶點(diǎn)提供了有效的研究方法［3］。通過(guò)篩選和預(yù)測(cè)“杜仲-牛膝”藥對(duì)和ONFH 中符合要求的相關(guān)靶點(diǎn)，并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，探討“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療股骨頭壞死潛在有效成分和作用機(jī)制。

1 方法

1.1 “杜仲-牛膝”藥對(duì)藥物潛在活性成分篩選通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)［4］（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）挖掘杜仲及牛膝的藥物有效成分?jǐn)?shù)據(jù)。根據(jù)成分毒藥物動(dòng)力學(xué)（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）參數(shù)［5］對(duì)“杜仲-牛膝”藥對(duì)藥物潛在活血成分進(jìn)行篩選，將藥物口服生物利用度［6］（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似度［7］（drug likeness，DL）≥0.18 定義為篩選條件，在此閾值篩選標(biāo)準(zhǔn)下結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)藥物有效成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行完善。

1.2 “杜仲-牛膝”藥對(duì)作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過(guò)使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中的有效成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)功能，獲得“杜仲-牛膝”藥對(duì)中有效作用成分的作用靶點(diǎn)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)［8］（https：//www.uniprot.org/）完成靶點(diǎn)基因名稱（Gene name）的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換，并篩選刪除重復(fù)靶點(diǎn)。

1.3 “杜仲-牛膝”藥對(duì)“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建使用網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape3.7.1 對(duì)活性成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。用節(jié)點(diǎn)（node）表示藥物、有效成分及靶蛋白，用邊（edge）表示其中的作用關(guān)系。利用Cytoscape3.7.1 軟件中的network analyzer 插件對(duì)活性成分-靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，以明確“杜仲-牛膝”藥對(duì)中活性成分作用靶點(diǎn)的關(guān)系。

1.4 ONFH 相關(guān)疾病靶點(diǎn)獲取通過(guò)DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）、CTD（http：//ctdbase.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（http：//www.omim.org/）、PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）、GAD（https：//geneticassociationdb.nih.gov/）、KEGG（https：//www.kegg.jp/）等與疾病靶點(diǎn)相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)，以“osteonecrosis of the femoral head”及“osteoecrosis”為關(guān)鍵詞對(duì)已知的ONFH 疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索及篩選，檢索截止時(shí)間為2019 年12 月18 日。綜合上述數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)并保留唯一值，即可獲得已知的ONFH相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

1.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析將“杜仲-牛膝”藥對(duì)作用靶點(diǎn)及ONFH 疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射后，使用TBtools 繪圖軟件作出韋恩圖，即可獲得“杜仲-牛膝”藥對(duì)與ONFH 的交集靶點(diǎn)，初步得到“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療ONFH的潛在作用靶點(diǎn)。

將初步得到的潛在作用靶點(diǎn)輸入至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)［9］（http：//string-db.org），STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)是研究蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫(kù)，其信息量大，涵蓋物種范圍最多，有利于潛在作用靶點(diǎn)的獲得。物種定義為“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）。將數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入至Cytoscape，分析蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)度值，其節(jié)點(diǎn)度值越大則代表其在相互作用網(wǎng)絡(luò)中作用越重要。其中，將節(jié)點(diǎn)度值前十位定義為“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療ONFH 的關(guān)鍵靶點(diǎn)。最后使用Cytoscape軟件將蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化處理。

1.6 Pathway 富集分析利用Cytoscape 中基因富集分析插件ClueGO 對(duì)上述獲得的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因表達(dá)數(shù)據(jù)的批量處理及注釋，完成功能富集分析（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析，以節(jié)點(diǎn)-作用關(guān)系的形式繪圖將結(jié)果圖像化展示，并繪制餅狀圖，以反映各靶點(diǎn)參與的主要信號(hào)通路的重要程度。其中，同種顏色的節(jié)點(diǎn)所代表的信號(hào)通路為同種類型，節(jié)點(diǎn)的大小反映信號(hào)通路的作用顯著情況。

2 結(jié)果

2.1 “杜仲-牛膝”藥對(duì)活性成分分析通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘杜仲及牛膝的藥物有效成分?jǐn)?shù)據(jù)，獲得“杜仲-牛膝”藥對(duì)相關(guān)藥物潛在活性成分。杜仲活性成分共147 個(gè)，牛膝活性成分共176 個(gè)，其中滿足OB 值≥30%、DL≥0.18 的活性成分中杜仲有28 個(gè)，牛膝20 個(gè)。根據(jù)ADME 參數(shù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)滿足OB≥30% 與DL≥0.18 閾值篩選標(biāo)準(zhǔn)的藥物潛在活性成分共有45個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 “杜仲-牛膝”有效成分基本信息

續(xù)表1

2.2 “杜仲-牛膝”藥對(duì)作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)通過(guò)TCMSP 有效成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)功能對(duì)上述“2.1”項(xiàng)入血活性成分進(jìn)行作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，篩選去重后共獲得預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)140 個(gè)。利用Cytoscape 軟件對(duì)“杜仲-牛膝”藥對(duì)的入血活性成分及預(yù)測(cè)的作用靶點(diǎn)進(jìn)行作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的繪制及分組，其中“杜仲-牛膝”藥對(duì)活性成分與作用靶點(diǎn)共存在886 個(gè)相互關(guān)系，作用靶點(diǎn)共181個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 “杜仲-牛膝”藥對(duì)活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 ONFH 的疾病作用靶點(diǎn)通過(guò)上述“1.3”項(xiàng)中疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得ONFH 疾病相關(guān)靶點(diǎn)29、1317、49、5、35、46、5 個(gè)，取并集并篩除重復(fù)項(xiàng)后共獲得ONFG 疾病靶點(diǎn)1159 個(gè)。然后與“杜仲-牛膝”藥對(duì)活性成分的作用靶點(diǎn)取交集，繪制藥物與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖，兩者交集靶點(diǎn)共47 個(gè)，即已經(jīng)獲得的“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療ONFH 的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)數(shù)量。見(jiàn)圖2。

圖2 藥物與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果“該網(wǎng)絡(luò)中共有節(jié)點(diǎn)45個(gè)（導(dǎo)入文件時(shí)可見(jiàn)，CA2 和ADH1C 與其他靶點(diǎn)蛋白均未關(guān)聯(lián)，故將其移除）、邊421 條。關(guān)聯(lián)度較高的靶點(diǎn)蛋白包括IL-6、TNF、TP53、MAPK1、VEGFA、EGF、JUN、EGFR、NOS3、CCL2 等，將其定義為該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)。見(jiàn)表2、圖3。

圖3 “杜仲-牛膝”藥對(duì)治療ONFH的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 “杜仲-牛膝”治療ONFH的關(guān)鍵靶點(diǎn)（節(jié)點(diǎn)度值排序前10位）

2.5 富集分析結(jié)果通過(guò)使用Cytoscape 軟件中的插件ClueGo對(duì)“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療ONFH過(guò)程中的上述45 個(gè)可能關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析。結(jié)果可見(jiàn)，“杜仲-牛膝”藥對(duì)對(duì)于ONFH 治療過(guò)程的關(guān)鍵靶點(diǎn)所涉及的主要信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)、癌癥相關(guān)通路、骨形成與骨吸收、成骨成血管耦聯(lián)信號(hào)通路及細(xì)胞增殖及凋亡過(guò)程等信號(hào)通路相關(guān)。見(jiàn)圖4—5。

圖4 “杜仲-牛膝”藥對(duì)治療ONFH關(guān)鍵靶點(diǎn)GO分析圖

圖5 “杜仲-牛膝”藥對(duì)治療ONFH關(guān)鍵靶點(diǎn)信號(hào)通路富集分析圖

3 討論

股骨頭壞死是一種以骨組織結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致力學(xué)性能改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的骨科領(lǐng)域難治性疾病，好發(fā)于青壯年，該病發(fā)展至中晚期往往會(huì)導(dǎo)致股骨頭軟骨下骨塌陷等致髖關(guān)節(jié)功能喪失，有較高的致殘率，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此，針對(duì)股骨頭壞死的治療方法主要包括藥物治療、髓心減壓治療、高壓氧治療等保髖治療方法，以及人工髖關(guān)節(jié)置換等［10］。中醫(yī)學(xué)將股骨頭壞死歸于“骨蝕”“骨痹”等范疇，其基本病機(jī)為氣滯血瘀，肝腎虧虛，精虧不能濡養(yǎng)骨髓［11］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎為先天之本，《四圣心源》曰：“髓骨者，腎水之所生也，腎氣盛則髓骨堅(jiān)凝而輕利。”［12］腎精的盛衰與骨的生長(zhǎng)發(fā)育有密切的關(guān)系。ONFH 的病機(jī)為腎氣虧虛，筋骨失養(yǎng)，故治則應(yīng)以補(bǔ)腎活血為治療重點(diǎn)。

“杜仲-牛膝”藥對(duì)是中醫(yī)藥治療股骨頭壞死臨床過(guò)程中常用的重要藥對(duì)，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，杜仲的有效活性成分主要包括丁子香萜、β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素等，其功能包括抗抗癌、抗衰老、神經(jīng)功能保護(hù)等［13］。牛膝的有效活性成分為黃連素、β-蛻皮甾酮、漢黃芩素、槲皮素等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其主要具有抗炎、抗衰老等作用［14］。

“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療ONFH 的PPI 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，其治療具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，提示其作用機(jī)制是多蛋白多靶點(diǎn)的復(fù)合作用。在該網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)度值排序前10 位依次為IL-6、TNF、TP53、MAPK1、VEGFA、EGF、JUN、EGFR、NOS3、CCL2，可能為“杜仲-牛膝”藥對(duì)治療ONFH 過(guò)程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中，IL-6 作為炎癥反應(yīng)分子在單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的分化過(guò)程中有重要作用［15］。MAPK1、JUN 為絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路中的重要參與成員，與在力學(xué)刺激誘導(dǎo)下的骨細(xì)胞的增殖分化過(guò)程密切相關(guān)［16-17］，并且在細(xì)胞凋亡過(guò)程與炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。NOS3作為內(nèi)皮型NO合酶可促進(jìn)凋亡基因啟動(dòng)進(jìn)而導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡［18］，另外TNF等腫瘤壞死因子在成骨細(xì)胞凋亡過(guò)程中有一定調(diào)節(jié)作用。VEGFA 是誘導(dǎo)血管生成的關(guān)鍵分子，與基質(zhì)結(jié)合后可刺激加速骨血管生成和骨形成過(guò)程，在其過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［19］。

GO 和KEGG 富集分析結(jié)果顯示，“杜仲-牛膝”對(duì)于ONFH 的治療過(guò)程中，存在眾多信號(hào)通路的復(fù)合作用，并參與調(diào)控多方面的生物學(xué)進(jìn)程，該治療過(guò)程主要涉及、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及分化、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)及癌癥等相關(guān)通路。

首先，成骨、成血管相關(guān)通路。骨形成與脂肪分化的動(dòng)態(tài)平衡異常導(dǎo)致股骨頭局部血運(yùn)障礙是ONFH的重要發(fā)病機(jī)制，故影響調(diào)控成骨、成血管的相關(guān)信號(hào)通路是調(diào)控過(guò)程中的主要信號(hào)通路。上述結(jié)果顯示，與此相關(guān)的通路主要富集在HIF-1信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路等。PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖所示，核心靶點(diǎn)中的VEGFA 及PPARG 參與VEGF 信號(hào)通路的調(diào)控過(guò)程。微血管內(nèi)皮是骨脈管系統(tǒng)的重要組成部分，VEGF是機(jī)體促進(jìn)血管生長(zhǎng)的重要生長(zhǎng)因子。有研究證明，血管內(nèi)皮細(xì)胞可以直接分化為成骨細(xì)胞和生血細(xì)胞，并在成骨過(guò)程中發(fā)揮作用［20-21］。VEGF信號(hào)通路通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而參與骨與血管生成的生物學(xué)過(guò)程。HIF-1信號(hào)通路作為一個(gè)經(jīng)典的多功能信號(hào)通路，在細(xì)胞缺氧環(huán)境下，可以廣泛參與能量代謝、血管形成和細(xì)胞周期等生物過(guò)程，并且可以加強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨、成血管分化能力［22-24］。

其次，細(xì)胞增殖、分化及凋亡相關(guān)通路。骨吸收與骨重建的動(dòng)態(tài)平衡失常是ONFH 的重要發(fā)病機(jī)制，富集分析結(jié)果顯示，與此相關(guān)的信號(hào)通路主要包括PI3K/Akt、MAPK、HIF-1、破骨細(xì)胞分化通路等。其中，PI3K/AKT 信號(hào)通路及其下游靶蛋白在骨形成及骨重建過(guò)程中發(fā)揮重要作用［25］；PI3K/AKT 信號(hào)通路是一種廣泛存在于組織中調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是經(jīng)典的自噬信號(hào)通路之一，抑制該通路可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡，而活化該通路后可以通過(guò)抑制自噬過(guò)程來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受凋亡［26］。在細(xì)胞自噬、凋亡、細(xì)胞的增殖及分化、生長(zhǎng)和代謝中發(fā)揮重要作用，并且與蛋白質(zhì)的合成有密切關(guān)系［27-29］。當(dāng)PI3K被激活后，其激活產(chǎn)物磷脂酰肌醇三磷酸與AKT 結(jié)合，AKT 完成由細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位過(guò)程，同時(shí)構(gòu)象發(fā)生變化，完成活化過(guò)程繼而進(jìn)一步激活下游靶蛋白，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過(guò)程［30］；絲裂酶原活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路作為重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，可以將細(xì)胞外的刺激信號(hào)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子的活性來(lái)參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及凋亡、細(xì)胞骨架重構(gòu)及炎癥介導(dǎo)等過(guò)程參與多種生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境變化刺激時(shí)，如創(chuàng)傷性刺激、炎癥因子、細(xì)胞外高滲環(huán)境和脂多糖等，均可使MAPK 信號(hào)通路激活，從而發(fā)揮其調(diào)控作用參與上述過(guò)程［31-32］。有研究表明其下游的ERK1/2信號(hào)通路參與成骨細(xì)胞的多種生理過(guò)程［33］。

最后，炎癥等相關(guān)信號(hào)通路。ONFH 具有無(wú)菌性炎癥表現(xiàn)，關(guān)于炎癥反應(yīng)環(huán)境的通路調(diào)控顯得尤為重要。TNF 是組成炎癥急性期反應(yīng)的細(xì)胞因子之一，參與全身炎癥反應(yīng)，可以誘導(dǎo)白細(xì)胞介素的產(chǎn)生［34-35］。當(dāng)其結(jié)合受體激活MAPK 信號(hào)通路時(shí)，可引起基質(zhì)金屬蛋白酶升高、軟骨細(xì)胞凋亡及軟骨破壞等病理反應(yīng)［36-37］；在AGE-RAGE 信號(hào)通路中，AGEs 與RAGE 結(jié)合后激活下游信號(hào)通路，可導(dǎo)致細(xì)胞功能產(chǎn)生異常，并激活細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子NF-κB［38-39］，加速炎癥反應(yīng)發(fā)生。

綜上所述，通過(guò)調(diào)控成骨成血管、細(xì)胞的分化與凋亡、炎癥反應(yīng)及全身應(yīng)激反應(yīng)等信號(hào)通路，“杜仲-牛膝”藥對(duì)在ONFH 的治療可起到有效的積極作用。