基于網絡藥理學探討杜仲-牛膝治療股骨頭壞死的分子機制

溫明韜，梁學振，許 波，劉金豹，楊振勛，李 剛

山東中醫藥大學，山東 濟南 250355

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）又稱股骨頭無菌性壞死（aseptic necrosis，AN）、股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis，AVN），指由于各種原因引起的股骨頭血液循環障礙，導致股骨頭的周圍組織壞死病變進而發展為股骨頭塌陷的一類常見骨科疾病。其主要臨床表現為患側髖部疼痛、髖關節功能障礙［1］，如未得到有效治療，大部分患者會發展至股骨頭塌陷而造成髖關節功能受限，嚴重影響患者生活質量并且帶來沉重的生活負擔。該病屬于祖國醫學“骨蝕”“骨痹”等范疇。《素問》曾有“腎者水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發為骨痿”的記載［2］。中醫治則以補腎活血為治療重點。“杜仲-牛膝”作為中醫藥治療ONFH 的常用配伍藥對，二者歸肝、腎經，均可活血通經、補益肝腎。在應用于臨床治療ONFH 的長時間過程中，取得了較為滿意的臨床療效。但由于中藥成分相對復雜，相關中藥藥效學分析及毒理機制研究不足，有效活性成分及作用機制缺乏準確可靠的研究結果支撐。網絡大數據分析、網絡藥理學和生物信息學理論的建立，為研究中藥潛在活性成分和作用靶點提供了有效的研究方法［3］。通過篩選和預測“杜仲-牛膝”藥對和ONFH 中符合要求的相關靶點，并對靶點進行富集分析，探討“杜仲-牛膝”藥對治療股骨頭壞死潛在有效成分和作用機制。

1 方法

1.1 “杜仲-牛膝”藥對藥物潛在活性成分篩選通過檢索中藥系統藥理學數據庫［4］（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）挖掘杜仲及牛膝的藥物有效成分數據。根據成分毒藥物動力學（absorption and distribution and metabolism and excretion，ADME）參數［5］對“杜仲-牛膝”藥對藥物潛在活血成分進行篩選，將藥物口服生物利用度［6］（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似度［7］（drug likeness，DL）≥0.18 定義為篩選條件，在此閾值篩選標準下結合文獻對藥物有效成分數據進行完善。

1.2 “杜仲-牛膝”藥對作用靶點預測通過使用TCMSP 數據庫中的有效成分靶點預測功能，獲得“杜仲-牛膝”藥對中有效作用成分的作用靶點。利用Uniprot數據庫［8］（https：//www.uniprot.org/）完成靶點基因名稱（Gene name）的標準轉換，并篩選刪除重復靶點。

1.3 “杜仲-牛膝”藥對“活性成分-靶點網絡”構建使用網絡可視化軟件Cytoscape3.7.1 對活性成分及作用靶點進行網絡構建。用節點（node）表示藥物、有效成分及靶蛋白，用邊（edge）表示其中的作用關系。利用Cytoscape3.7.1 軟件中的network analyzer 插件對活性成分-靶點進行網絡特征分析，以明確“杜仲-牛膝”藥對中活性成分作用靶點的關系。

1.4 ONFH 相關疾病靶點獲取通過DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）、CTD（http：//ctdbase.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（http：//www.omim.org/）、PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）、GAD（https：//geneticassociationdb.nih.gov/）、KEGG（https：//www.kegg.jp/）等與疾病靶點相關的數據庫，以“osteonecrosis of the femoral head”及“osteoecrosis”為關鍵詞對已知的ONFH 疾病相關靶點進行檢索及篩選，檢索截止時間為2019 年12 月18 日。綜合上述數據庫數據并保留唯一值，即可獲得已知的ONFH相關疾病靶點。

1.5 PPI 網絡構建和分析將“杜仲-牛膝”藥對作用靶點及ONFH 疾病相關靶點進行映射后，使用TBtools 繪圖軟件作出韋恩圖，即可獲得“杜仲-牛膝”藥對與ONFH 的交集靶點，初步得到“杜仲-牛膝”藥對治療ONFH的潛在作用靶點。

將初步得到的潛在作用靶點輸入至STRING數據庫［9］（http：//string-db.org），STRING 數據庫是研究蛋白相互作用網絡的數據庫，其信息量大，涵蓋物種范圍最多，有利于潛在作用靶點的獲得。物種定義為“Homo sapiens”，構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction，PPI）。將數據文件導入至Cytoscape，分析蛋白相互作用網絡中各個節點的節點度值，其節點度值越大則代表其在相互作用網絡中作用越重要。其中，將節點度值前十位定義為“杜仲-牛膝”藥對治療ONFH 的關鍵靶點。最后使用Cytoscape軟件將蛋白相互作用網絡可視化處理。

1.6 Pathway 富集分析利用Cytoscape 中基因富集分析插件ClueGO 對上述獲得的關鍵靶點進行基因表達數據的批量處理及注釋，完成功能富集分析（gene ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析，以節點-作用關系的形式繪圖將結果圖像化展示，并繪制餅狀圖，以反映各靶點參與的主要信號通路的重要程度。其中，同種顏色的節點所代表的信號通路為同種類型，節點的大小反映信號通路的作用顯著情況。

2 結果

2.1 “杜仲-牛膝”藥對活性成分分析通過TCMSP 數據庫挖掘杜仲及牛膝的藥物有效成分數據，獲得“杜仲-牛膝”藥對相關藥物潛在活性成分。杜仲活性成分共147 個，牛膝活性成分共176 個，其中滿足OB 值≥30%、DL≥0.18 的活性成分中杜仲有28 個，牛膝20 個。根據ADME 參數篩選標準，同時滿足OB≥30% 與DL≥0.18 閾值篩選標準的藥物潛在活性成分共有45個。見表1。

表1 “杜仲-牛膝”有效成分基本信息

續表1

2.2 “杜仲-牛膝”藥對作用靶點預測通過TCMSP 有效成分靶點預測功能對上述“2.1”項入血活性成分進行作用靶點預測，篩選去重后共獲得預測作用靶點140 個。利用Cytoscape 軟件對“杜仲-牛膝”藥對的入血活性成分及預測的作用靶點進行作用關系網絡的繪制及分組，其中“杜仲-牛膝”藥對活性成分與作用靶點共存在886 個相互關系，作用靶點共181個，見圖1。

圖1 “杜仲-牛膝”藥對活性成分-靶點網絡圖

2.3 ONFH 的疾病作用靶點通過上述“1.3”項中疾病靶點數據庫分別獲得ONFH 疾病相關靶點29、1317、49、5、35、46、5 個，取并集并篩除重復項后共獲得ONFG 疾病靶點1159 個。然后與“杜仲-牛膝”藥對活性成分的作用靶點取交集，繪制藥物與疾病靶點的韋恩圖，兩者交集靶點共47 個，即已經獲得的“杜仲-牛膝”藥對治療ONFH 的潛在關鍵靶點數量。見圖2。

圖2 藥物與疾病靶點韋恩圖

2.4 PPI 網絡分析結果“該網絡中共有節點45個（導入文件時可見，CA2 和ADH1C 與其他靶點蛋白均未關聯，故將其移除）、邊421 條。關聯度較高的靶點蛋白包括IL-6、TNF、TP53、MAPK1、VEGFA、EGF、JUN、EGFR、NOS3、CCL2 等，將其定義為該PPI網絡中的核心節點。見表2、圖3。

圖3 “杜仲-牛膝”藥對治療ONFH的PPI網絡圖

表2 “杜仲-牛膝”治療ONFH的關鍵靶點（節點度值排序前10位）

2.5 富集分析結果通過使用Cytoscape 軟件中的插件ClueGo對“杜仲-牛膝”藥對治療ONFH過程中的上述45 個可能關鍵靶點進行富集分析。結果可見，“杜仲-牛膝”藥對對于ONFH 治療過程的關鍵靶點所涉及的主要信號通路與炎癥反應、癌癥相關通路、骨形成與骨吸收、成骨成血管耦聯信號通路及細胞增殖及凋亡過程等信號通路相關。見圖4—5。

圖4 “杜仲-牛膝”藥對治療ONFH關鍵靶點GO分析圖

圖5 “杜仲-牛膝”藥對治療ONFH關鍵靶點信號通路富集分析圖

3 討論

股骨頭壞死是一種以骨組織結構破壞導致力學性能改變為主要表現的骨科領域難治性疾病，好發于青壯年，該病發展至中晚期往往會導致股骨頭軟骨下骨塌陷等致髖關節功能喪失，有較高的致殘率，嚴重影響患者生活質量。因此，針對股骨頭壞死的治療方法主要包括藥物治療、髓心減壓治療、高壓氧治療等保髖治療方法，以及人工髖關節置換等［10］。中醫學將股骨頭壞死歸于“骨蝕”“骨痹”等范疇，其基本病機為氣滯血瘀，肝腎虧虛，精虧不能濡養骨髓［11］。中醫學認為腎為先天之本，《四圣心源》曰：“髓骨者，腎水之所生也，腎氣盛則髓骨堅凝而輕利。”［12］腎精的盛衰與骨的生長發育有密切的關系。ONFH 的病機為腎氣虧虛，筋骨失養，故治則應以補腎活血為治療重點。

“杜仲-牛膝”藥對是中醫藥治療股骨頭壞死臨床過程中常用的重要藥對，現代藥理研究發現，杜仲的有效活性成分主要包括丁子香萜、β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素等，其功能包括抗抗癌、抗衰老、神經功能保護等［13］。牛膝的有效活性成分為黃連素、β-蛻皮甾酮、漢黃芩素、槲皮素等，現代藥理學研究發現，其主要具有抗炎、抗衰老等作用［14］。

“杜仲-牛膝”藥對治療ONFH 的PPI 蛋白相互作用網絡分析結果顯示，其治療具有多成分、多靶點的特點，提示其作用機制是多蛋白多靶點的復合作用。在該網絡中，節點度值排序前10 位依次為IL-6、TNF、TP53、MAPK1、VEGFA、EGF、JUN、EGFR、NOS3、CCL2，可能為“杜仲-牛膝”藥對治療ONFH 過程中的關鍵靶點。其中，IL-6 作為炎癥反應分子在單核細胞、淋巴細胞的分化過程中有重要作用［15］。MAPK1、JUN 為絲裂原活化蛋白激酶信號通路中的重要參與成員，與在力學刺激誘導下的骨細胞的增殖分化過程密切相關［16-17］，并且在細胞凋亡過程與炎癥反應中發揮重要作用。NOS3作為內皮型NO合酶可促進凋亡基因啟動進而導致骨細胞凋亡［18］，另外TNF等腫瘤壞死因子在成骨細胞凋亡過程中有一定調節作用。VEGFA 是誘導血管生成的關鍵分子，與基質結合后可刺激加速骨血管生成和骨形成過程，在其過程中發揮關鍵作用［19］。

GO 和KEGG 富集分析結果顯示，“杜仲-牛膝”對于ONFH 的治療過程中，存在眾多信號通路的復合作用，并參與調控多方面的生物學進程，該治療過程主要涉及、細胞凋亡、細胞增殖及分化、炎癥、應激反應及癌癥等相關通路。

首先，成骨、成血管相關通路。骨形成與脂肪分化的動態平衡異常導致股骨頭局部血運障礙是ONFH的重要發病機制，故影響調控成骨、成血管的相關信號通路是調控過程中的主要信號通路。上述結果顯示，與此相關的通路主要富集在HIF-1信號通路、VEGF信號通路等。PPI網絡分析圖所示，核心靶點中的VEGFA 及PPARG 參與VEGF 信號通路的調控過程。微血管內皮是骨脈管系統的重要組成部分，VEGF是機體促進血管生長的重要生長因子。有研究證明，血管內皮細胞可以直接分化為成骨細胞和生血細胞，并在成骨過程中發揮作用［20-21］。VEGF信號通路通過對血管內皮生長因子的表達進行調控，進而參與骨與血管生成的生物學過程。HIF-1信號通路作為一個經典的多功能信號通路，在細胞缺氧環境下，可以廣泛參與能量代謝、血管形成和細胞周期等生物過程，并且可以加強骨髓間充質干細胞的成骨、成血管分化能力［22-24］。

其次，細胞增殖、分化及凋亡相關通路。骨吸收與骨重建的動態平衡失常是ONFH 的重要發病機制，富集分析結果顯示，與此相關的信號通路主要包括PI3K/Akt、MAPK、HIF-1、破骨細胞分化通路等。其中，PI3K/AKT 信號通路及其下游靶蛋白在骨形成及骨重建過程中發揮重要作用［25］；PI3K/AKT 信號通路是一種廣泛存在于組織中調控細胞增殖、分化及凋亡過程的信號轉導通路，是經典的自噬信號通路之一，抑制該通路可以誘導細胞自噬和凋亡，而活化該通路后可以通過抑制自噬過程來保護細胞免受凋亡［26］。在細胞自噬、凋亡、細胞的增殖及分化、生長和代謝中發揮重要作用，并且與蛋白質的合成有密切關系［27-29］。當PI3K被激活后，其激活產物磷脂酰肌醇三磷酸與AKT 結合，AKT 完成由細胞質到細胞膜的轉位過程，同時構象發生變化，完成活化過程繼而進一步激活下游靶蛋白，調控細胞的增殖、分化及凋亡過程［30］；絲裂酶原活化蛋白激酶級聯反應通路作為重要的細胞內信號轉導通路之一，可以將細胞外的刺激信號傳遞到細胞核內，通過調控多種轉錄因子的活性來參與細胞增殖、細胞分化及凋亡、細胞骨架重構及炎癥介導等過程參與多種生理過程的調節。當細胞受到外界環境變化刺激時，如創傷性刺激、炎癥因子、細胞外高滲環境和脂多糖等，均可使MAPK 信號通路激活，從而發揮其調控作用參與上述過程［31-32］。有研究表明其下游的ERK1/2信號通路參與成骨細胞的多種生理過程［33］。

最后，炎癥等相關信號通路。ONFH 具有無菌性炎癥表現，關于炎癥反應環境的通路調控顯得尤為重要。TNF 是組成炎癥急性期反應的細胞因子之一，參與全身炎癥反應，可以誘導白細胞介素的產生［34-35］。當其結合受體激活MAPK 信號通路時，可引起基質金屬蛋白酶升高、軟骨細胞凋亡及軟骨破壞等病理反應［36-37］；在AGE-RAGE 信號通路中，AGEs 與RAGE 結合后激活下游信號通路，可導致細胞功能產生異常，并激活細胞炎癥反應的關鍵因子NF-κB［38-39］，加速炎癥反應發生。

綜上所述，通過調控成骨成血管、細胞的分化與凋亡、炎癥反應及全身應激反應等信號通路，“杜仲-牛膝”藥對在ONFH 的治療可起到有效的積極作用。