濟陰顆粒對雌性冠心病大鼠脂代謝的影響

黃 赫，齊 越，王若冰，張 瑜，趙 磊△

1 遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，遼寧 沈陽 110034；2 江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學校

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心病）是最常見的心血管疾病［1］，是婦女死亡的主要原因之一［1-2］。相關研究［3-6］表明，絕經前女性冠心病的發(fā)病率較低，癥狀不典型，因此，探討冠心病的復雜發(fā)病機制，尤其是女性冠心病的發(fā)病機制已迫在眉睫，而在分子水平上對冠心病進行研究是一種其有前沿性的研究方法［7］。

脂代謝紊亂常伴有血脂生化指標包括血清總膽 固 醇（total cholesterol，TC）、甘 油 三 酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）和/或高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）異常升高［8-9］。脂代謝異常是肝臟、糖尿病、冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化、高血壓和各種心血管疾病的主要危險因素之一［10］。絕經期女性脂質代謝紊亂經常被忽視，與更年期綜合征混淆，其具體機制還不明朗。中藥復方濟陰顆粒由生地黃、淫羊藿、香附、丹參、黃柏組成，主要用于治療絕經綜合征肝腎陰虛證。本研究采用去卵巢雌性冠心病大鼠模型模擬絕經期冠心病大鼠，在分子水平上探究濟陰顆粒對絕經期冠心病大鼠脂質代謝的影響，為絕經期冠心病女性脂質代謝紊亂的防治、中藥新藥研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥健康雌性SD 大鼠75 只，體質量（200±20）g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（遼）2015-0001。

1.2 試藥與儀器RNA 提取試劑RE-03012（FOREGENE 公司，批號：R190701）；反轉錄試劑盒RR047A［寶生物工程（大連）有限公司，批號：095634］；ABclonal 2×快速熒光定量qRCR 反應預混液（低Rox）RK21202（ABclonal 公司，批號：190601）；大鼠TC ELISA 試劑（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：201912）；Multiskan FC 酶標儀，ABI7500實時定量PCR儀（德國Thermo公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備75只健康SD雌性大鼠適應性喂養(yǎng)7 天后，隨機分為空白組、模型組、西藥對照組、中藥對照組、濟陰顆粒組5 組，每組15 只。除空白組外，其余各組大鼠制備絕經期冠心病模型：去除雙側卵巢，術后腹腔注射青霉素（華北制藥股份有限公司，批號：F8008502）3 天以防感染，陰道分泌物涂片確定未出現感染后進行冠心病造模：除空白組外所有大鼠每天給予高脂飼料［11］［3% 膽固醇（ 成都華夏化學試劑有限公司，批號：P354464），0.5% 膽酸鈉（成都華夏化學試劑有限公司，批號：P436521），0.2% 丙基硫氧嘧啶（成都華夏化學試劑有限公司，批號：P243652），5% 白糖，10% 豬油］連續(xù)8 周，造模第7、14 天分別給予維生素D3注射液（江蘇吳中醫(yī)藥集團有限公司蘇州制藥廠，批號：14122501，規(guī)格：30 萬IU/支，50萬IU/支）50 萬IU/kg、30 萬IU/kg 注射液灌胃，第7 周給予異丙腎上腺素注射劑（上海禾豐制藥有限公司，批號：41160302，規(guī)格：1 mg/支）（ISO）5 mg/kg多點皮下注射，連續(xù)1周［12］。

1.3.2 給藥及標本采集西藥對照組每日灌服1 次阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，批號：X67405，規(guī)格：10 mg/片）2 mg/kg；中藥對照組每日灌服1次珍珠靈芝片（湖南正清制藥集團股份有限公司，國藥準字1903107，規(guī)格：0.32 g/片）0.17 g/kg；濟陰顆粒組每日灌服1次濟陰顆粒［生地黃、淫羊藿、丹參、香附、黃柏免煎顆粒劑（江陰天江藥業(yè)有限公司，批號：18334517、18112331、19032831、19051161、19032251），規(guī)格：10 g/包］7.8 g/kg；空白組、模型組每日1 次灌服同等容積蒸餾水。各組于給藥8 周后取材，分離主動脈，液氮速凍后保存在-80℃冰箱。

1.3.3 試劑盒提取大鼠主動脈血管RNA取新鮮組織每10～20 mg 加入500 μL Buffer RL1，玻璃勻漿器或電動勻漿器將組織研磨均勻；將研磨均勻的勻漿液轉移至DNA 清洗柱（DNA-cleaning column）中，12 000 r/min（13 400×g）離心2 min。移除DNA-Cleaning Column，保留收集管內上清液；向上述上清液（體積應約為500 μL）中加入1.6 倍體積Buffer RL2（使用前請確認已按照說明加入無水乙醇），輕柔混勻；將700 μL 混合液轉移至RNA-only Column 中（純化柱放入收集管中），12 000 r/min（13 400×g）離心1 min，棄掉收集管中的廢液；將純化柱放回收集管中，將剩余混合液全部加入純化柱中，12 000r/min（13 400×g），離心1 min，棄掉收集管中的廢液；向純化柱中加入500 μL Buffer RW1，12 000r/min（13 400×g）離心1 min，棄掉收集管中的廢液；向純化柱中加入700 μL Buffer RW2（使用前請確認已按照說明加入無水乙醇），12 000r/min（13 400×g）離心1 min，棄掉收集管中的廢液，重復1 次；將純化柱放回收集管中，12 000 r/min（13 400×g）空管離心2 min，去掉離心柱中殘余的Buffer RW2；將純化柱轉移至新的離心管中，向純化柱的膜中央滴加50～200 μL 已于65℃預熱的RNase-Free ddH2O（切勿將洗脫液添加到壓圈上，否則會損失較大體積的洗脫液），室溫放置2 min。12000r/min（13 400×g）離心1 min 收集RNA 溶液。為提高RNA 產量，可將離心得到的RNA 溶液重新加至純化柱中，重復步驟1次。

1.3.4 mRNA反轉錄為cDNA反應反應1：5×gDNase Mix 2.0 μL，Template（RNA）5 μL，RNase-Free ddH2O 3 μL，42℃2 min，4℃+∞；反應2：反應液110 μL，5×ROEasy Mix 4 μL，RNaseFree ddH2O 6 μL，37℃15 min，85℃5 s，4℃+∞。

1.3.5 實時定量PCR反應cDNA 0.4 μL，上游引物（10 μM）0.4 μL，下游引物（10 μM）0.4 μL，2×SYBR Green Fast qPCR Mix with Low Rox 10 μL，ddH2O 8.8 μL，95℃2 min；95℃15 s，60℃1 min，72℃1min，40cycles；95℃15s，60℃1min，95℃15 s，60℃15 s。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.6 ELISA 測定大鼠血清總膽固醇含量標準品的加樣：設置標準孔和樣本孔，標準品孔加不同濃度的標準品50 μL；加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步驟相同）；待測樣品孔；在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋劑40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5 倍）；加樣將樣品加于酶標孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；加酶：每孔加入酶標試劑100 μL，空白孔除外；溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60 min；配液：將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用；洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，沒空加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干；顯色：每孔加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 分鐘；終止：每孔加入終止液50 μL，終止反應；測定：以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

1.4 統(tǒng)計學方法所有數據采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s 表示，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠主動脈ABCA1 mRNA 水平與空白組相比，模型組ABCA1 mRNA表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；同模型組比較，西藥對照組、中藥對照組、濟陰顆粒組ABCA1 mRNA 表達顯著增加（P＜0.01）。見圖1。

圖1 大鼠主動脈ABCA1 mRNA表達水平

2.2 大鼠主動脈ApoA1 mRNA 水平與空白組相比，模型組ApoA1 mRNA表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；同模型組比較，西藥對照組、中藥對照組、濟陰顆粒組ApoA1 mRNA 表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 大鼠主動脈ApoA1 mRNA表達水平

2.3 大鼠主動脈CAV1 mRNA 水平與空白組相比，模型組CAV1 mRNA 表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。同模型組比較，西藥對照組、中藥對照組CAV1 mRNA表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），濟陰顆粒組CAV1 mRNA 表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 大鼠主動脈C AV 1 m R N A 表達水平

2.4 大鼠主動脈LDLR mRNA 水平與空白組相比，模型組LDLR mRNA 表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同模型組比較，西藥對照組、中藥對照組、濟陰顆粒組LDLR mRNA 表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖4。

圖4 大鼠主動脈LD LR m R N A 表達水平

2.5 大鼠主動脈SRB1 mRNA 水平與空白組相比，模型組SRB1 mRNA 表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。同模型組比較，西藥對照組、中藥對照組、濟陰顆粒組SRB1 mRNA 表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖5。

圖5 大鼠主動脈S R B 1 m R N A 表達水平

2.6 大鼠主動脈VLDLR mRNA 水平與空白組相比，模型組VLDLR mRNA表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。2）同模型組比較，西藥對照組、中藥對照組VLDLR mRNA表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），濟陰顆粒組VLDLR mRNA表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖6。

圖6 大鼠主動脈V LD LR m R N A 表達水平

2.7 大鼠血清總膽固醇含量測定與空白組相比，模型組總膽固醇含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；同模型組比較，西藥對照組、中藥對照組總膽固醇含量顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），濟陰顆粒組總膽固醇含量減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖7。

圖7 大鼠血清總膽固醇含量

3 討論

近年來，女性冠心病患者的比例持續(xù)增長，并且主要為老年婦女［13-14］，女性患冠心病的時間大約比男性晚10 年，潛在的原因可能是絕經前雌激素的保護作用［13，15-16］，65 歲以上的女性患冠心病的風險是65歲以下的女性的3倍［13，17-18］。

小窩蛋白1（caveolin-1，Cav-1）已被報道與脂質代謝有較好相關性［19］。小窩介導脂質的跨膜轉運和脂蛋白分子的內吞和外吞［20-21］。除了囊泡介導的脂質轉運外，小窩中的各種受體，如LDLR、SR-B1 和ABCA1，介導脂質流出［22］。Cav-1 富含囊泡、內質網和高爾基體，通過囊泡的細胞內沉降在細胞漿和細胞膜之間穿梭［23-24］。脂蛋白受體，如極低密度脂蛋白受體（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）和低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR），以及脂質轉運蛋白，如ABCA1和SRB1，構成跨膜脂質轉運系統(tǒng)［25-28］。脂蛋白，包括極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）和蛋白質膽固醇輸送蛋白（cholesteryl ester transfer protein，CETP）構成一個細胞外脂質沉積系統(tǒng)。調節(jié)血清脂蛋白受體水平是降低血清膽固醇和甘油三酯的作用機制之一。 載脂蛋白A1（apolipoprotein-A1，ApoA1）是高密度脂蛋白的主要結構蛋白。現有數據表明，ApoA1和ABCA1之間的功能性相互作用對ApoA1 的初始脂肪化是必要的［29］。通過一系列的中間步驟脂肪化的ApoA1形成盤狀的HDL 顆粒，可在卵磷脂膽固醇酰基轉移酶（lecithin cholesterol acyl transferase，LCAT）的作用下轉化為球形顆粒。

脂質代謝在冠心病中起著重要作用［30］。HDL是冠心病的保護因素［31］，LDL 是冠狀動脈疾病的危險因素［32］。TC 和TG 水平也與冠心病相關［33-34］。血脂異常是脂質異常轉運的直接結果，通過脂質轉運蛋白及其受體在脂質轉運中發(fā)揮關鍵作用［8］。實時定量PCR結果顯示，模型組大鼠ABCA1、ApoA1、CAV1、LDLR、SRB1、VLDLR mRNA 水平顯著低于空白組、西藥對照組、中藥對照組，可能是雌性大鼠患冠心病后脂質轉運減少，因此轉運相關受體mRNA 相對表達量減少。 濟陰顆粒組大鼠ABCA1、ApoA1、CAV1、LDLR、SRB1、VLDLR mRNA 水平高于模型組，可能是給予濟陰顆粒后，CAV-1、各種受體如LDLR、VLDLR、SR-B1和ABCA1 mRNA相對表達量增加以介導脂質流出，同時高密度脂蛋白的結構蛋白ApoA1 mRNA 相對表達量增加。ELISA 結果顯示，空白組、西藥對照組、中藥對照組、濟陰顆粒組總膽固醇含量低于模型組，因此推測濟陰顆粒可能通過降低總膽固醇水平以治療去卵巢雌性大鼠冠心病脂質代謝紊亂。

中醫(yī)認為，脂質代謝病是痰濕內阻所致，高脂飲食引起脾胃功能障礙，導致體內脂肪積聚，最終導致痰濕內阻［35］。本研究從脂質代謝角度檢測濟陰顆粒對去卵巢雌性冠心病大鼠脂質代謝紊亂的療效，表明濟陰顆粒能降低去卵巢雌性冠心病血清TC 水平。對濟陰顆粒降脂作用機制的進一步研究表明，濟陰顆粒可上調ABCA1、ApoA1、CAV1、LDLR、SRB1、VLDLR mRNA 水平。綜上所述，濟陰顆粒是一種通過調節(jié)載脂蛋白、載脂蛋白受體、脂質轉運水平和降低總膽固醇水平而起作用的中藥小復方，推測可能對絕經期女性脂質代謝紊亂有一定治療效果。