三七抗血小板聚集及抗凝作用機制研究

朱心怡，王 琪，趙赟霄，2，3，宋雅雅，2，3，張 威，2，3，趙益明，2，3△

1 蘇州大學附屬第一醫院，江蘇 蘇州 215006；2 江蘇省血液研究所；3 衛生部血栓與止血重點實驗室；4 鹽城市第一人民醫院

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）中發病率前三位的分別是心肌梗死、卒中和靜脈血栓栓塞癥［1］。動脈栓塞和靜脈栓塞是兩種相對獨立的疾病，起病隱匿，發作兇險，在中老年人中發病率高，危害大［2］。這兩種疾病的復雜發病機理存在許多共同點，如血液高凝狀態和血小板活化作用［3］。但栓塞患者普遍伴有高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病、癌癥等基礎性疾病，故在采用低分子肝素、華法林和阿司匹林等藥物進行預防時具有一定的風險。

三七，又名田七，是五加科植物Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen 三七的干燥根，性溫，味甘微苦，具有化瘀止血、活血祛痛的功效。其化學成分以皂苷類和氨基酸類為主，活性成分則以三七總皂苷和三七素為代表［4］。近年來，三七作為一味活血化瘀的中藥在血栓相關疾病和中老年人保健方面的應用愈加廣泛。臨床研究提示，三七對腎臟［5］、肝臟［6］以及神經系統［7］具有保護作用［8］。本研究以三七為試藥，探討該藥的抗血小板凝聚及抗凝作用的機制，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料征集10位健康志愿者，其中男5例，女5 例；平均年齡（35.40±9.86）歲；均已簽署知情同意書。

1.2 藥物與試劑三七粉購自蘇州市天靈中藥飲片有限公司（產于云南，批號：180201），經蘇州大學附屬第一醫院中藥師周翔鑒定為五加科植物三七的粉末；PL-12 血小板聚集分析儀和配套稀釋液、質控品及膠原蛋白（collgen，COL，批號：180201）、腎上腺素（epinephrine，EPI，批號：171228）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，arachidonic acid，ADP，批號：180409）、花生四烯酸（arachidonic acid，AA，批號：180208）均由江蘇英諾華醫療科技有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 血小板聚集試驗志愿者每日口服三七3 g，連續服用5日。女性避開月經期。在服藥前，服藥第3、6 日分別采集志愿者肘靜脈血5 mL。再分別以COL、EPI、ADP和AA為誘導聚集劑誘導血小板聚集［9］，記錄血小板最大誘導聚集率（maximum platelet aggregation rate，MAR）并及時分離未經過誘導聚集處理的血漿和誘導聚集后的上清，-20℃凍存備用。

1.3.2 P-選擇素含量測定采用酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定P-選擇素（P-selectin）含量，嚴格按說明書（試劑盒由濟南中楚有限公司提供）進行操作。Varioskan flash 酶標儀讀取光密度（optical density，OD）值，以標準曲線稀釋度為橫坐標，相應OD值為縱坐標，擬合曲線，計算各血漿標本P-選擇素含量。

1.3.3 VWF：Ag 含量測定采用ELISA 雙抗體夾心法：用江蘇省血液研究所研制并保存的小鼠抗人VWF 的單克隆抗體SZ-29 以2 μg/mL 的濃度包板，2% BSA-PBS小牛血清白蛋白溶液封閉。1∶20、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000 梯度稀釋正常人混合血漿作為標準曲線，1∶100 稀釋待測血漿。以辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的另一株小鼠抗人VWF 的單克隆抗體SZ-34 作為酶標二抗。鄰苯二胺（o-Phenylene‐diamine dihydrochloride，OPD）顯色，3M 硫酸終止，酶標儀讀取各孔在492 nm 處OD 值。以標準曲線稀釋度為橫坐標，相應OD 值作為縱坐標，繪圖。半對數回歸方程擬合后計算各樣本血漿中血管性血友病因子抗原（von willebrand factor antigen，VWF：Ag）含量（%）［10］。

1.3.4 凝血參數實驗室測定凝血酶時間（thrombin time，TT）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）和凝血酶原時間（prothrombin time，PT）。

1.4 統計學方法采用SPSS 19.0對數據進行統計分析，采用GraphPad Prism 5.0 進行圖片處理，計量資料采用±s 表示，采用t 檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血小板聚集試驗志愿者服用三七后的第3、6 天以COL、EPI、ADP 和AA 所誘導的MAR 與服藥前比較均顯著降低（P＜0.05）；服藥第6 天與第3天比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1，圖1。血小板聚集抑制率動態變化，見圖2。

圖1 不同時間點血小板MAR示意圖

圖2 不同時間點血小板MAR動態圖

表1 10例志愿者不同時間點血小板MRA比較（±s） %

表1 10例志愿者不同時間點血小板MRA比較（±s） %

注：與服藥前比較，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001

時間服藥前服藥第3天服藥第6天例數10 10 10誘導劑COL 57.43±9.91 46.01±9.28**50.09±11.70*EPI 71.06±9.51 62.76±8.80***64.74±12.22**ADP 49.08±12.10 45.66±4.72**48.62±8.38*AA 62.99±6.56 58.10±9.90**52.95±12.69*

2.2 P-selection 含量與服藥前比較，服藥后第3、6 天P-selection 含量降低（P＜0.05）；EPI、ADP和AA所誘導聚集后分離的血清上清中的P-選擇素的含量也顯著下降（P＜0.05）。見表2。

2.3 VWF∶Ag 含量與服藥前比較，服藥后第3、6天志愿者血漿中VWF∶Ag 含量均降低（P＜0.05），且服藥第6天較服藥第3天降低更顯著（P＜0.05）。見表2。

2.4 凝血參數與服藥前比較，服藥第3、6 天TT、APTT 和TT 均延長（P＜0.05），且服藥第6 天TT、APTT均低于服藥第3天（P＜0.05）。見表2。

表2 10名志愿者不同時間點P-selection、VWF∶g含量及凝血參數比較（±s）

表2 10名志愿者不同時間點P-selection、VWF∶g含量及凝血參數比較（±s）

注：*表示與服藥前比較，P＜0.05；△表示與服藥第3天比較，P＜0.05

時間服藥前服藥第3天服藥第6天P-selection（ng/mL）plamsa 9.56±2.94 8.27±2.49*6.92±2.84*COL 11.85±2.64 11.01±3.13 9.77±2.62*EPI 12.11±2.91 10.71±2.80*9.39±3.34*ADP 11.26±2.50 10.94±2.60 9.20±2.50*AA 11.69±2.67 11.10±3.11 8.81±2.61*△VWF：Ag（%）102.37±10.38 98.47±8.19 91.60±4.05*△TT（s）17.63±0.56 18.08±0.76*18.52±0.74*△APTT（s）43.18±3.61 43.47±4.26 47.31±6.81*△PT（s）14.28±0.76 15.02±1.33 14.98±1.32*

3 討論

三七是我國珍貴的傳統中藥，小劑量的三七可以起到止血作用，大劑量三七具有活血作用［11］。研究表明［12-13］，三七不在下肢靜脈曲張術后和人工膝關節的置換術后能起到預防深靜脈血栓的效果，還能保護損傷的內皮細胞結構和功能的完整性［14-15］，這為三七具有抗血栓作用提供了佐證。

本研究顯示，在口服三七前后，不同誘導聚集劑所誘導的MAR 都在正常范圍內，前后數據相比較時發現服用三七后，4 種針對血小板不同受體的誘導聚集劑所誘導的MAR 都有下降。并檢測到血漿中可發揮止血作用的VWF∶Ag 含量和血小板活化標志物P-選擇素含量同時減少，提示血小板黏附及活化后釋放能力的下調。而在常規凝血參數的檢測中，三七對內源性凝血途徑篩查指標APTT、外源性凝血途徑篩查指標PT 和共同凝血途徑篩查指標TT具有延長的作用。

綜述所述，三七從抑制血小板黏附、聚集、釋放方面上起到抗血小板作用，并且在內源、外源和共同凝血途徑都表現出了抗凝作用。本研究亦提示了三七可應用于對阿司匹林等抗血栓藥物具有抵抗作用的患者的可能性。

本研究的不足之處主要包括樣本量較小和口服三七時間短兩個問題，后續研究可擴大樣本量，延長口服三七時間，并針對不同年齡層次的志愿者的血小板功能及凝血功能進行進一步的研究。