姜黃素抑制庫普夫細胞活化作用的機制研究?

黃珍愷，丁 煒

南京醫科大學第一附屬醫院，江蘇 南京 210000

急性肝損傷（acute liver injury，ALI）是在無慢性肝臟疾病的情況下出現急性肝損傷，臨床主要表現為凝血功能障礙、黃疸和肝性腦病［1］。最新研究主要是根據黃疸出現和肝性腦病出現之間的間隔來將急性肝損傷分為超急性、急性和亞急性［2-4］。近年來研究發現庫普夫細胞（kupffer cells，KCs）在ALI中起著重要作用，KCs可以分泌多種細胞因子加重肝損傷［5］。例如KCs 可以分泌腫 瘤 壞死 因子α（tumor necrosis factor- α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）加重肝臟炎癥，促進肝細胞凋亡［6］；分泌單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、CC家族趨化因子配體7（C-C motif chemokine ligand 7，CCL7）促進單核細胞浸潤；分泌CXC 家族趨化因子配體1（C-X-C Motif Chemokine Ligand 1，CXCL1）、CXC 家族趨化因子配體2（C-XC Motif Chemokine Ligand 2，CXCL2），促進中性粒細胞浸潤進一步擴大肝臟炎癥［7-8］，因此抑制KCs活化成為治療急性肝損傷的重要靶點。

姜黃素是姜黃Curcuma longa L. 的主要活性成分，從姜黃的干燥根莖粉中提取。動物實驗表明［9-10］，姜黃素對急性肝損傷具有明確的保護作用，但具體機制仍不清楚。本研究擬從體外實驗觀察姜黃素對KCs 的作用，并以此來解釋姜黃素對急性肝損傷的保護作用。

1 材料與儀器

1.1 實驗細胞KCs 提取于正常SPF 級雄性C57BL/6小鼠，肝臟KCs的提取和培養采用原位灌注、離體膠原酶消化和梯度離心法，相關步驟參照吳明兵等［11］的操作方法。

1.2 藥物及試劑姜黃素（美國abcam 公司，純度＞95%，HPLC，批號：ab120618）；LPS（美國R&D 公司，批號：L2630）；WB一抗抗體ERK1/2（美國CST公司，批號：8544）；p-ERK1/2（美國CST 公司，批號：4376）；P38（美國CST 公司，批號：8690）；p-P38 抗體（美國CST 公司，批號：8632）；JNK（美國CST 公司，批號：9253）；p-JNK抗體（美國CST公司，批號：9255）；GAPDH（中國Bioworld公司，批號：AP0063）；WB 二抗-辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG（北京世紀康為公司，批號：CW010M）；Trizol 試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：15596-019）；DEPC水（上海碧云天生物公司，批號：R0021）；q-PCR 逆轉錄（日本TaKaRa公司，批號：號RR420A）；DMEM培養基（美國gibco 公司，批號：C11995500BT）；胎牛血清（美國gibco 公司，批號：10091-148）；雙抗（美國gibco 公司，批號：15140-122）；q-PCR 熒光試劑盒（日本TaKaRa公司，批號：RR036A）。

1.3 實驗儀器applied biosystems Quant-StudioTM 6 Flex Real-time-PCR 儀（美國Life Technologies）；applied biosystems 2720 Thermal cycler 型RNA 逆轉錄儀（美國Life Technologies）；PowerPacTMUniversal 型電泳儀（美國BIO-RAD 公司）；Tanon 5200 Multi 型全自動數碼凝膠成像分析系統（上海天能科技有限公司）；3111型細胞培養箱（美國Thermo Fisher）；EL-01-220型單模塊金屬浴（美國major science）；V2 S025型渦旋振蕩器（德國IKA），IKA mini G 型微型離心機（德國IKA）；Heraeus Fresco 21 型冷凍高速離心機（美國Thermo Fisher）；Bx60 型生物顯微鏡（日本Olympus）；T50型勻漿機（德國IKA）。

2 實驗方法

2.1 細胞活力實驗首先通過細胞毒理實驗篩選合適的藥物實驗濃度：用完全培養基（包含44%DMEM 培養基、5%FBS 和1% 雙抗）重懸KCs，調整細胞濃度至5x104/mL。96孔板每孔中加入150 μL細胞懸液，并置于細胞培養箱中培養2 h。在不同的培養孔中分別加入不同濃度姜黃素（0、2.5、5、10、20、40和80 μM），每個濃度設3個副孔，預處理共培養3 h 后，每孔加入400 ng/m LPS，繼續在培養箱中孵育12 h。然后將96孔板拿出，將每個孔加入細胞增殖/毒性的試劑（Cell Counting Kit-8，CCK-8）10 μL，繼續培養30 min。最后用設定為450 nm波段的酶標儀讀取各孔數據。見圖1。

圖1 姜黃素對KCs活力示意圖

2.2 姜黃素干預實驗根據姜黃素預實驗結果，選取了本次姜黃素實驗藥物濃度：2.5、5、10 μM。用完全培養基（包含44% DMEM 培養基、5% FBS 和1% 雙抗）重懸KCs，調整細胞濃度至5x104/mL。6孔板中分別加入4 mL，并在各孔中加入不同濃度的姜黃素（0、2.5、5、10 μM），每個濃度設3 個副孔，預處理共培養3 h后，每孔加入400 ng/mLLPS，繼續在培養箱中孵育12 h。然后收集細胞蛋白和mRNA進行檢測相關指標。

2.3 炎癥因子和趨化因子mRNA 水平采用實時定量PCR 方法檢測KCs 細胞中炎癥因子和趨化因子mRNA變化，吸棄KCs培養上清，用4℃預冷的PBS清洗兩遍，加入1 mL TRozl進行裂解核蛋白。根據TRIzol試劑操作說明提取細胞中的總RNA，然后根據PrimeScript RT Master Mix 試劑盒操作說明將其轉化為cDNA，最后根據SYBR Premix ExTaq試劑盒操作說明在Step-One Plus 上進行了實時定量PCR。每個樣本3 個復孔，得到閾循環值（Ct）平均值，計算△△CT值，各個樣本的mRNA表達水平均以2-△△CT表示。最終結果由軟件自動求出。引物序列號見表1。

表1 引物序列號

2.4 通路蛋白檢測采用Western 印跡法檢測KCs中細胞通路蛋白，吸棄KCs培養上清，用4℃遇冷的PBS清洗兩遍，利用凱基全蛋白提取試劑盒提取細胞全蛋白。用雙氰胺酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量蛋白質后，用10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離總蛋白，轉移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。將PVDF 膜在3% 牛血清白蛋白（bicinchoninic acid，BSA）中在室溫封閉1 h，然后與各種一抗抗體孵育：ERK1/2（1∶2000）、p-ERK1/2（1∶2000）、P38（1∶2000）、p-P38抗體（1∶1000）、JNK（1∶1000）、p-JNK抗體（1∶2000）4℃過夜，TBST洗滌6次，3 min×3次，10 min×3次。然后與羊抗兔IgG二抗（1∶10000）孵育1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入化學發光試劑，并在全自動數碼凝膠成像分析系統上發光成像，留取圖片，行蛋白半定量分析。

2.5 統計學方法采用SPSS 22.0統計軟件進行分析，計量資料以±s 表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 KCs 鑒定體外分離原代細胞后，予以含10%FBS 和1% 雙抗的DMEM 培養基中培養。體外培養30 min 后可見KCs 細胞貼壁。培養48 h 后，可見細胞呈現出星型、多角形和梭形，伸出偽足，見圖2A。通過流式細胞術檢測其純度，可見KCs 細胞（CD45+F4/80+細胞）比例達95%，見圖2B，可用于進一步實驗。

圖2 體外分離培養小鼠肝臟KCs和流式鑒定

3.2 炎癥因子水平與空白對照組相比，LPS 刺激KCs 后炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA表達均明顯升高（P＜0.01）。而予以姜黃素預處理之后，KCs表達的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA 則顯著降低（P＜0.01），且呈現出明顯的劑量依賴性，高劑量組TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達較低劑量組和中劑量組明顯降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 姜黃素抑制LPS誘導的KCs分泌炎癥因子水平

3.3 趨化因子水平與空白對照組相比，LPS 刺激KCs 后趨化因子CXCL1、CXCL2 和MCP-1 的mRNA表達均明顯升高（P＜0.01）。而予以姜黃素預處理之后，KCs表達的炎癥因子CXCL1、CXCL2和MCP-1的mRNA則顯著降低，且呈現明顯的劑量依賴性，高劑量組CXCL1、CXCL2 和MCP-1 的mRNA 表達較低劑量組和中劑量組明顯降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 姜黃素抑制LPS誘導的KCs分泌趨化因子水平

3.4 ERK1/2、P38和JNK通路LPS刺激和姜黃素預處理后ERK1/2、P38和JNK蛋白的總蛋白表達沒有變化，但ERK1/2、P38 和JNK 蛋白磷酸化水平明顯升高。通過IPP軟件對WB條帶進行的灰度值測算，可見姜黃素抑制LPS 引起的的ERK1/2、P38 和JNK蛋白磷酸化水平具有劑量依賴性。見圖5。

圖5 姜黃素抑制LPS誘導的信號通路表達

4 討論

急性肝損傷是世界性的醫療難題，多種病理因素均可以導致急性肝損傷的發生，如藥源性的撲熱息痛、病毒性的乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）和甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus）及酒精等因素［4，12］。在美國，每年接近30 萬人因服用撲熱息痛而導致急性肝損傷［1］。既往研究發現，藥物及酒精引起的急性肝損傷發生機制與肝臟細胞內過度氧化應激有關，而HBV 引起的急性肝損傷和細胞毒性T 細胞過度活化相關［13］。近年來研究發現，固有免疫也參與急性肝損傷，特別是Kupffer 細胞在急性肝損傷中起著重要的作用，抑制Kupffer細胞功能可以緩解肝損傷［5，13］。

近年來對KCs 在急性肝損傷中的作用研究頗多，大量研究表明，其主要是通過分泌炎癥相關細胞因子和趨化因子從而加重肝損傷［5，9］。CAMILLE等［14］研究發現，KCs 在肝損傷早期可以被損傷相關的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）分子激活后分泌大量促炎細胞因子，如TNF-α、IL-1β 和IL-6。這些促炎因子進一步加重肝臟炎癥，促進肝細胞凋亡。KUBES等［15］研究發現，KCs 分泌CXCL1 和CXCL2 趨化中性粒細胞浸潤，中性粒細胞浸潤后通過死亡受體直接導致肝細胞凋亡［16］。另外，進一步研究發現Kupffer 細胞分泌CCL7 和MCP-1 趨化單核細胞浸潤，導致Ly6Chi單核細胞浸潤［15］。這些單核細胞浸潤后通過分泌促炎和促纖維化細胞因子擴大肝臟炎癥，并引起肝臟纖維化［17］。

姜黃素是從姜黃干燥根莖粉中提取的主要活性成分。多項體內、體外實驗均證實姜黃素對急性肝損傷具有治療作用［18-19］。本實驗通過姜黃素與KCs 體外實驗發現，姜黃素可以抑制LPS 和KCs促炎細胞因子和趨化因子的分泌，提示姜黃素可能通過抑制KCs 分泌促炎細胞因子和趨化因子來減輕肝臟炎癥。KCs 活化分泌細胞因子與ERK1/2通路磷酸化相關。本研究發現姜黃素可以降低LPS 和KCs 共培養后ERK1/2 通路磷酸化水平，提示姜黃素可能是通過抑制ERK1/2通路來抑制KCs活化分泌細胞因子。ERK1/2、P38和JNK蛋白通路是公認的巨噬細胞活化、分泌細胞因子和趨化因子的重要細胞通路［20-21］，本研究結果表明姜黃素抑制LPS 引起的的ERK1/2、P38 和JNK 蛋白磷酸化水平具有劑量依賴性。

綜上所述，通過體外實驗證實姜黃素可以抑制KCs 活化，減少促炎細胞因子和趨化因子的分泌，解釋了姜黃素治療ALF 的機理。為姜黃素的臨床應用提供科學合理的理論依據，也提示了姜黃素可能是治療急性肝損傷的有效藥物之一。