高效液相色譜法測定藍(lán)莓提取物中 花色苷含量的測量不確定度評(píng)定

◎ 胡玉霞

（浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

藍(lán)莓物種名為越橘，杜鵑花科越橘屬植物（Vaccinium），是多年生灌木漿果果樹，20世紀(jì) 80年代由美國引入，因其果實(shí)為藍(lán)色而得名[1]。目前我國藍(lán)莓種植省份多達(dá)27個(gè)，產(chǎn)量大于50000 t[2]。藍(lán)莓水果營養(yǎng)價(jià)值高，可即食亦可深加工為果醬、果干、果汁等。藍(lán)莓的深藍(lán)色主要是因?yàn)槠淦と庵懈缓ㄉ眨ㄉ沼苫ㄉ睾吞且蕴擒真I結(jié)合而成，屬黃酮類物質(zhì)[3-5]，是一種有效的天然自由基清除劑，有抗氧化、抗衰老、抗癌等功效，在食品生產(chǎn)、生物制藥、護(hù)膚品等領(lǐng)域有應(yīng)用前景[6-8]。藍(lán)莓中的花色苷主要集中在深色的皮肉中，然而在實(shí)際加工中，藍(lán)莓渣大多卻被作為廢料處理，浪費(fèi)了資源。要開發(fā)藍(lán)莓渣深加工，變廢為寶，就需要對(duì)藍(lán)莓中花色苷的含量進(jìn)行測定，而不確定度評(píng)定是衡量檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要指標(biāo)[9]。本文以藍(lán)莓渣的提取物干粉為樣品，應(yīng)用高效液相色譜法，對(duì)其中最為常見的一種花色苷矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量進(jìn)行不確定度評(píng)定，為藍(lán)莓提取物中花色苷含量的檢測方法提供不確定度參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇，HPLC；乙腈，HPLC；甲酸，GR；磷酸，GR；鹽酸，GR；標(biāo)準(zhǔn)品：矢車菊素-3-O-葡萄糖苷氯化物，純度99.9%；藍(lán)莓提取物干粉（浙江藍(lán)美生物）。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoU3000高效液相色譜儀配二級(jí)陣列檢測 器；ME203E梅 特 勒 電 子 天 平（0.0001 g）；ZorbaxExtend-C18液相色譜柱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用分析天平稱取花色苷矢車菊素葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品0.08 g，用2%（V/V）鹽酸甲醇溶解，超聲15 min使之完全溶解，定容至20 mL即得400 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)原液（-20 ℃保存7個(gè)月）。用移液管移取標(biāo)準(zhǔn)原液5 mL至25 mL的容量瓶中，用10%（V/V）磷酸水溶液定容即得80 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（-20 ℃保存 30 d）。

1.3.2 樣品處理

用分析天平準(zhǔn)確稱取0.125 g樣品倒入25 mL的容量瓶中，用2%（V/V）鹽酸甲醇約15 mL溶解，超聲處理15 min，置冷后定容。用移液管移取上述溶液5～25 mL的容量瓶中，用10%（V/V）磷酸水溶液定容，過0.45 μm濾膜，待液相色譜分析。

1.3.3 液相色譜條件

選用ZorbaxExtend-C18液相色譜柱，二級(jí)陣列檢測器，檢測波長535 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1，流動(dòng)相A（10%甲酸水溶液）和流動(dòng)相B（甲酸∶水∶乙腈∶甲醇=40∶160∶90∶90），梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫條件表

1.4 建立數(shù)學(xué)模型

1.4.1 檢測程序

稱取分析試樣，質(zhì)量用m表示；用一定體積2%鹽酸甲醇溶液超聲處理，定容V1；分取V2，用10%磷酸水溶液稀釋定容至V3；試樣液及標(biāo)準(zhǔn)品過膜經(jīng)HPLC分析測定，得到樣液中矢車菊素葡萄糖苷含量c；計(jì)算樣品中矢車菊素葡萄糖苷含量x。

1.4.2 數(shù)學(xué)模型

藍(lán)莓提取物樣品中矢車菊素葡萄糖苷含量檢測的數(shù)學(xué)模型：

式中：x-試樣中矢車菊素葡萄糖苷含量，g·kg-1；c-處理樣液中矢車菊素葡萄糖苷的濃度，μg·mL-1；m-稱取試樣質(zhì)量，g；V1-稱取樣品定容體積，mL；V2-分取體積，mL；V3-分取樣品定容體積，mL；frep-重復(fù)性系數(shù)，由實(shí)驗(yàn)中各種隨機(jī)因素產(chǎn)生，數(shù)值上為1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源

由檢測程序和數(shù)學(xué)模型可知，檢驗(yàn)過程中產(chǎn)生的不確定度主要包括稱樣過程、樣液定容過程、樣液稀釋過程、標(biāo)液配制過程、色譜儀器檢測過程和樣品平行測定的不確定度6個(gè)部分，詳見圖1。

圖1 不確定度來源分析圖

2.2 不確定度分量評(píng)定

2.2.1 樣品稱量導(dǎo)致的不確定度urel（m）

稱量所用萬分之一分析天平的最大允許誤差是±0.0001 g，服從均勻分布k=，故電子天平稱取0.125 g樣品過程導(dǎo)致的相對(duì)不確定度為：

2.2.2 樣液定容導(dǎo)致的不確定度urel(v1)

（1）定容體積產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。樣品稱量后定容至25 mL容量瓶，根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[10]A級(jí)容量允差±0.03 mL，按均勻分布取。

（2）定容溫度變化所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為常溫（20±5）℃，容量瓶檢定溫度為20 ℃，此時(shí)水的膨脹系數(shù)是0.0018 /℃，取均勻分布則。

樣品定容時(shí)導(dǎo)致的合成不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 樣液稀釋產(chǎn)生的不確定度urel（V2-3）

（1）移液管分取樣液產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。用單標(biāo)線移液管移取5 mL樣液，其容量允差為±0.015 mL，按均勻分布取。

（2）定容產(chǎn)生的不確定度。稀釋定容至25 mL，不確定度由容量瓶容積和溫度變化兩部分組成，計(jì)算同2.2.2：

樣液稀釋導(dǎo)致的合成不確定度：

樣品稀釋導(dǎo)致的相對(duì)不確定度：

2.2.4 標(biāo)液配制過程導(dǎo)致的不確定度urel(s)

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度。所購買的標(biāo)品矢車菊素葡萄糖苷純度為99.9%，出廠標(biāo)物證書標(biāo)示其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為±0.2%，k=2，屬正態(tài)分布，則由標(biāo)準(zhǔn)品純度導(dǎo)致的相對(duì)不確定度為：

（2）標(biāo)樣稱量引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)品稱樣量為0.08 g，析天平的最大允許誤差是±0.0001 g，服從均勻分布，標(biāo)品稱量產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：

（3）標(biāo)樣定容引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)品定容過程產(chǎn)生的不確定度來自定容的容量瓶和溫度變化，計(jì)算方法同2.2.2，標(biāo)品定容至20 mL，20 mL容量瓶的最大允差為±0.03 mL，試驗(yàn)溫度為（20±5）℃，經(jīng)計(jì)算得urel(v2-3)=0.00527。

（4）標(biāo)樣稀釋引入的不確定度。標(biāo)樣稀釋過程同樣品稀釋過程2.2.3，則

（5）標(biāo)液配制過程產(chǎn)生的總相對(duì)不確定度。計(jì)算如下：

2.2.5 液相色譜儀產(chǎn)生的不確定度urel(q)

根據(jù)高效液相色譜儀校準(zhǔn)證書，液相色譜儀產(chǎn)生的不確定度為urel(q)=0.002。

2.2.6 樣品測定重復(fù)性引入的不確定度urel(frep)

樣品檢驗(yàn)過程中重復(fù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的不確定度主要包括樣品的均勻性、試劑的純度、天平和移液管、容量瓶的重復(fù)性等構(gòu)成，具有隨機(jī)性，屬于A類不確定度，對(duì)同一樣品，測定6平行，求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，詳見表2。樣品重復(fù)測定產(chǎn)生相對(duì)不確定度為urel(frep)=RSD=0.00323。

表2 藍(lán)莓粉中花色苷矢車菊素葡萄糖苷的含量表（n=6）

2.3 合成相對(duì)不確定度urel(y)

藍(lán)莓提取物中花色苷矢車菊素葡萄糖苷含量測定不確定度的來源及各分量的測定結(jié)果見表3，根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS-GL006:2019）[11]， 高效液相色譜花色苷矢車菊素測定的總合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表3 花色苷矢車菊素葡萄糖苷測定中各分量的 相對(duì)不確定度表

2.4 擴(kuò)展不確定度評(píng)定

樣品中花色苷矢車菊素的含量為77.34 g·kg-1，在95%置信區(qū)間，包含因子k=2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度u(y)=2×0.0112=0.0224，矢車菊素葡萄糖苷的擴(kuò)展不確定度為：U(Y)=77.34×0.0226=1.73 g·kg-1。

2.5 測量不確定度結(jié)果報(bào)告

用高效液相色譜法測定藍(lán)莓粉中花色苷矢車菊素葡萄糖苷，當(dāng)檢測結(jié)果為77.34 g·kg-1時(shí)，描述為x=（77.34±1.73）g·kg-1；k=2，置信區(qū)間95%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)花色苷矢車菊素葡萄糖苷檢測過程中可能產(chǎn)生不確定度的6個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行計(jì)算分析。由表3可知液相色譜測定藍(lán)莓提取物中花色苷矢車菊素的不確定度主要來自標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程，其貢獻(xiàn)率達(dá)到31.73%，其次是樣品提取的定容和稀釋過程，均占22.17%，其他因素的影響相對(duì)較小。在用此方法測定藍(lán)莓提取物中花色苷矢車菊素葡萄糖苷的過程中，為控制測定的不確定度，應(yīng)控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)主要是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和樣品處理過程，如盡量選擇合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，讓標(biāo)液濃度與檢測樣液濃度接近以減小定量誤差，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性；樣品前處理過程中，注意取樣均勻，選取檢定合格的玻璃量器，并規(guī)范操作，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。本實(shí)驗(yàn)樣品處理方法簡單，未考慮加標(biāo)回收過程不確定度的貢獻(xiàn)，且用單標(biāo)定量，未考慮標(biāo)曲擬合過程的不確定度，這些都需要日后繼續(xù)研究。