羅漢果黃素及其主要代謝物抗糖基化活性研究

◎ 陳 楊，童優蕓，李夢月，高藝笑，項穎芳，劉合生

（1.浙江萬里學院 生物與環境學院，浙江 寧波 315100；2.諾安檢測服務有限公司，浙江 寧波 315000）

隨著經濟發展水平的迅速提高及生活方式的改變，高糖、高脂肪的飲食結構及缺乏運動的生活方式使得糖尿病及其并發癥的發病率、死亡率及醫療成本呈現快速上升趨勢[1]。目前商品化的抗糖尿病藥物根據其作用機制不同可以分為多種類型，如α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑、二肽基肽酶抑制劑以及糖基化抑制劑等[2]。其中糖基化抑制劑可顯著減輕糖尿病癥狀、延緩糖尿病進程及降低糖尿病并發癥風險[3]。但是長期服用這類藥物容易引發多種毒副作用，如胃腸道紊亂、肝臟疾病、流感樣癥狀、罕見血管炎以及腎臟腫瘤等[4]，因此天然來源、特別是膳食來源的AGEs抑制劑因其具有無或輕微毒副作用、來源廣泛、食用方便及相對廉價等優點而受到廣泛關注[5]。大量文獻報道了天然來源提取物或其活性成分具有強烈抗AGEs或抗糖基化作用[6]。羅漢果黃素是羅漢果（Siraitia grosvenorii）果實中的一種特征性黃酮類化合物，其主要代謝物有山奈苷、α-rhamnoisorobin、阿福豆苷和山奈酚，均具有明顯的抗氧化活性，且代謝物活性比原形物的更高[7]。而抗氧化與抗糖基化作用顯著相關，因此羅漢果黃素是否具有顯著的抗糖基化活性有待驗證。經胃腸道消化、轉化后，羅漢果黃素代謝產物是否也具有抗糖基化作用，以及代謝前后抗糖基化活性是否變化，目前尚無相關文獻報道。因此，本項目擬利用牛血清白蛋白-果糖-葡萄糖（BSA-Fru-Glu）體外糖基化體系，探討羅漢果黃素及3種胃腸道主要代謝物山奈苷、阿福豆苷和山奈酚對AGEs抑制活性，以期為羅漢果抗糖尿病功能性食品的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅漢果黃素、阿福豆苷、山奈苷和山奈酚標準品購于成都普瑞法科技開發有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購于北京索萊寶科技有限公司；5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、葡萄糖以及果糖購于阿拉丁試劑有限公司；鹽酸氨基胍（AG）、硫黃素T來源于Sigma公司；果糖胺試劑盒購買于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

F-380熒光分光光度計，天津港東科技股份有限公司；Infinite M200 Pro多功能酶標儀，瑞士Tecan公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 體外糖基化體系

參照文獻[8]方法，略微修改。含10 mg·mL-1BSA的0.1 mol·L-1pH=7.4的磷酸鈉緩沖液（PBS），加入終濃度0.2 mol·L-1的果糖和0.2 mol·L-1的葡萄糖，再加入一定量溶解于10%二甲亞砜（DMSO）水溶液的羅漢果黃素、山奈苷、阿福豆苷、山奈酚和AG儲備溶液，使其終濃度分別為0.1 mmol L-1和1 mmol·L-1的羅漢果黃素、山奈苷、阿福豆苷和山奈酚的抑制劑組及陽性對照組，以含10 mg·L-1BSA、0.2 mol·L-1葡萄糖、0.2 mol·L-1果糖，不含抑制劑或陽性對照的 0.1 mol·L-1pH=7.4的PBS為模型組，以含10 mg·mL-1組，BSA的0.1 mol·L-1pH=7.4的PBS為 空 白 對 照組，同時做本底組（含相同濃度DMSO的抑制劑+PBS），所有組均加入終濃度為0.02%的疊氮化鈉，以抑制微生物生長。每個組設置3個平行，37 ℃恒溫水浴鍋中避光孵育4周，每周取樣測定下列指標。

1.3.2 晚期糖基化產物（AGEs）的檢測

參照文獻[8]方法并略做修改。移取150 μL糖基化樣品，置于黑色96孔板中，酶標儀于激發波長 350 nm，發射波長450 nm測定熒光強度。按下式計算抑制率：

式（1）中：F0為模型組（BSA-Fru-Glu）熒光強度；F1為抑制劑組熒光強度；F2為本底組熒光強度。

1.3.3 果糖胺含量測定

參照文獻[8]描述方法，略做修改。準確移取100 μL糖化樣品置于96孔板中，加入0.25 mmol·L-1氮藍四唑溶液（溶于0.1 mol·L-1pH=10.35的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液）100 μL，37 ℃孵育30 min，于530 nm處測定吸光度，按下式計算果糖胺含量：

式（2）中：A為530 nm測定的吸光度；L為光程（cm）；ε為摩爾消光系數，為12640 L·mol-1·cm-1；V1為測量體系總體積（mL）；10-3為mL與L的換算系數；109為mol與nmol的換算系數；c為BSA濃度（mg·mL-1）；V2為取樣體積（mL）；結果表示為nmol果糖胺/mg蛋白質。

1.3.4 蛋白羰基含量測定

參照報道[8]的方法，稍做修改。準確移取糖化BSA溶液100 μL，加入10 mmol·L-12,4-二硝基苯肼溶液（溶于2.5 mol·L-1鹽酸）400 μL，充分混合，黑暗中孵育1 h后，加入0.5 mL的20%（m/v）的三氯乙酸沉淀蛋白質，立即于冰上放置5 min，4 ℃，10000×g離心10 min，棄上清，沉淀用0.5 mL乙醇/乙酸乙酯（1∶1，v/v）混合液洗滌3次后，加入 6 mol·L-1的鹽酸胍溶液0.25 mL，反復渦旋至溶解，準確移取200 μL旋至至96孔板，酶標儀于370 nm處測定吸光度，樣品羰基含量按下式計算：

式（3）中：A為370 nm測定的吸光度；L為光程（cm），即96孔板液面高度；ε為2,4-二硝基苯肼的摩爾消光系數，為22000 L·mol-1·cm-1；V1為測定吸光度時樣液總體積，mL；10-3為mL與L的轉換系數；109為mol與nmol的轉換系數；c為BSA濃度，本試驗c=10 mg·mL-1；V2為取樣體積，mL；結果表示為nmol羰基/mg蛋白質。

1.3.5 巰基含量測定

參照文獻[8]方法，稍有修改。準確移取70 μL糖 化BSA溶液于96孔酶標板，加入130 μL的5 mmol·L-1DTNB溶 液（溶 于0.1 mol·L-1pH=7.4的PBS）， 25 ℃孵育15 min，酶標儀于412 nm處測定吸光度，按照同樣方法，以L-半胱氨酸（100-350 μmol·L-1）繪制標準曲線，以不加樣品的DTNB溶液調零，按照下式計算巰基含量：

式（4）中：c1為L-半胱氨酸標準曲線方程計算的濃度（μmol·L-1）；V1為取樣體積，μL；10-6為μL與L的轉換系數；c2為BSA濃度（mg·mL-1）；10-3為μL與mL的轉換系數；結果表示為μmol巰基/mg蛋白質。

1.3.6 類淀粉蛋白β交聯結構的測定

參照文獻[8]方法，略做修改。10 μL糖化BSA樣品置于黑色96孔板中，加入64 μmol·L-1硫磺素T溶液（溶于0.1 mol·L-1pH=7.4的PBS）100 μL，25 ℃孵育60 min，采用酶標儀于激發波長435 nm，發射波長485 nm測定熒光強度。

2 結果與分析

2.1 羅漢果黃素與其主要代謝產物的抗糖基化效果

本研究首先比較了羅漢果黃素與其主要代謝物山奈苷、阿福豆苷和山奈酚在低濃度（0.1 mmol·L-1）和高濃度（1 mmol·L-1）下孵育4周對BSA-Fru-Glu體外 孵育體系熒光AGEs的影響。如圖1所示，0.1 mmol·L-1處理4周，羅漢果黃素無明顯AGEs抑制作用 （P＞0.05），而山奈苷、阿福豆苷和山奈酚均顯示出較低的抑制作用，抑制率分別為6.2%、8.6%和9.6%。當1.0 mmol·L-1處理4周時，羅漢果黃素處理組的熒光強度無明顯變化（P＞0.05），而阿福豆苷、山奈苷和山奈酚處理組的熒光AGEs顯著減低（P＜0.05），呈現劑量依賴性，山奈酚的抑制作用最強，抑制率達62.6%，顯著高于羅漢果黃素和另外2種代謝物 （P＜0.05），為此后續試驗以山奈酚為研究對象。

圖1 羅漢果黃素及其主要代謝產物山奈苷、 阿福豆苷和山奈酚對糖基化的抑制作用圖

2.2 山奈酚體外抗糖基化活性

2.2.1 山奈酚對果糖胺形成的影響

圖2表明，低劑量（0.1 mmol·L-1）山奈酚對果糖胺形成無明顯抑制作用（P＞0.05），而高劑量 （1 mmol·L-1）盡管在第1和第4周對果糖胺含量無顯著抑制作用（P＞0.05），但第2、3周對其具有顯著抑制作用（P＜0.05），抑制效果與陽性對照（氨基胍，AG）相當，且該抑制作用呈現劑量依賴性。與Fru-Glu-BSA組比較，1 mmol·L-1山奈酚或AG孵育 3周，果糖胺含量分別降低了27.7%和33.1%。

圖2 山奈酚對體外糖基化體系果糖胺形成的影響圖

2.2.2 山奈酚對蛋白質氧化的影響

圖3a表明低濃度（0.1 mmol·L-1）山奈酚處理 4周對糖基化體系羰基水平無明顯影響（P＞0.05），但高濃度（1 mmol·L-1）山奈酚在前期的抑制效果優于后期；類似地，0.1 mmol·L-1山奈酚在整個試驗周期對體系的巰基水平無明顯影響（P＞0.05），但是與模型組比較，1 mmol·L-1山奈酚在前3周提升了巰基水平，但第4周與模型組無明顯差異（P＞0.05）。 與BSA-Fru-Glu組比較，1 mmol·L-1山奈酚孵育3周，羰基水平降低了19.4%，巰基水平上升了16.7%，提示山奈酚對糖基化誘導的蛋白質氧化有抑制 作用。

圖3 山奈酚對體外糖基化體系蛋白質氧化的影響圖

2.2.3 山奈酚對糖基化誘導的蛋白質交聯的影響

蛋白質糖基化形成的活性二羰基化合物加速蛋白質-蛋白質之間形成交聯結構，使其功能受損和缺失。圖4表明高濃度（1 mmol·L-1）山奈酚作用4周，明顯抑制β淀粉樣蛋白交聯結構的形成（P＜0.05），與模型組比較，降低了49.2%；而低劑量（0.1 mmol·L-1）在糖基化初期，對β淀粉樣蛋白交聯結構形成具有較弱的抑制作用，而后期表現出一定的促進作用，這可能與山奈酚在低濃度有促氧化作用，而高濃度有抗氧化作用有關。

圖4 山奈酚對體外糖基化體系β淀粉樣蛋白交聯結構 形成的影響圖

3 結論

羅漢果黃素在體外無明顯抗糖基化作用，但經胃腸道消化酶及腸道菌群作用后，形成的主要代謝產物山奈苷、阿福豆苷和山奈酚具有明顯的體外抗糖基化活性，其活性次序為山奈苷＜阿福豆苷＜山奈酚，表明糖配基數量與羅漢果黃素主要代謝物的抗糖基化活性負相關。