循環免疫熒光法助力組織學多靶標共染

傅椿輝，周洪輝，陳惠玲，王麗杰，陳 泳，楊清海

免疫組化染色是一種研究組織形態和原位蛋白表達的重要技術，對腫瘤的診斷、鑒別診斷、指導治療、判斷預后等方面具有重要作用[1]。組織切片可以為細胞和組織生物學提供豐富的信息。在同一張切片上，傳統免疫組化染色通常只能對1～2種抗原進行染色分析，隨著精準醫學的發展和蛋白質組學更加深入的研究，如不同蛋白間的相互作用，共表達和共定位，表達量與空間和距離關系，腫瘤異質性分析，細胞表型統計，腫瘤微環境呈現等均需在一張組織切片上同時檢測多個靶標分子[2-5]。本研究介紹一種利用循環免疫熒光的方法，可以同時顯示至少5個以上靶標分子，免疫熒光染色與熒光基團的化學滅活結合抗原抗體分離的快速非破壞性方法交替進行，通過數字病理切片掃描儀，可以在不丟失任何信息的情況下捕獲每一輪染色結果，用軟件疊加每一輪染色結果，最終實現多重免疫熒光染色。

1 材料與方法

1.1 材料硫酸、高錳酸鉀、硼氫化鈉購自國藥公司；DAPI購自Vector公司；ER、PR、HER-2兔單克隆抗體，Ki-67、CK5/6鼠單克隆抗體，EDTA抗原修復液、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自福州邁新公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗小鼠IgG、羅丹明(rhodamine)標記的山羊抗兔IgG購自Abcam公司，3D Histech Pannoramic MIDI數字切片掃描儀、CaseView圖像分析軟件購自濟南丹吉爾公司。

1.2 方法

1.2.1免疫熒光 (1)乳腺癌石蠟切片脫蠟、水化，自來水沖洗并浸泡于水中待用；(2)取適量EDTA(1 ∶50)抗原修復液倒入不銹鋼鍋中，將不銹鋼鍋置于電磁爐上，大功率加熱至沸騰；(3)將功率調至最小(處于保溫狀態)，將切片置于耐高溫染色架上，放入已沸騰的修復液中，蓋上鍋蓋繼續加熱20 min；(4) 室溫自然冷卻10 min，可用自來水在不銹鋼鍋外壁沖淋加速鍋內修復液冷卻，冷卻至室溫后取出切片，自來水沖洗干凈，PBS沖洗3 min×3。(5)除去PBS，切片上滴加ER兔單克隆抗體(1 ∶50)和Ki-67鼠單克隆抗體(1 ∶50)混合液，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3 min×3；(6)除去PBS，切片上滴加FITC標記的山羊抗小鼠IgG(1 ∶100)和rhodamine標記的山羊抗兔IgG(1 ∶100)混合液，室溫下孵育30 min，PBS沖洗3 min×3；(7)流水沖洗，風干切片，滴加DAPI復染液封固。

1.2.2抗體洗脫和熒光淬滅 染好的切片經Pannoramic MIDI數字切片掃描儀進行熒光掃描后，小心地移去蓋玻片，蒸餾水清洗，切片上滴加0.15 mol/L KMnO4、0.01 mol/L H2SO4溶液2 min，流水沖洗，放入新鮮配置的4.4 mol/L NaBH4(pH 9.0)中10 min，流水沖洗，PBS浸泡5 min，即可徹底洗脫抗體和淬滅熒光[8-9]。接著可進行第二輪免疫熒光染色，方法從1.2.1步驟5加一抗開始。

1.2.3熒光掃描與圖像分析 每一輪染色后，采用3D Histech Pannoramic MIDI數字切片掃描儀進行熒光掃描。掃描前先設置抗體標記的偽彩顏色，可以設置任意顏色。采用CaseView圖像軟件對每一輪的熒光圖像進行對齊，疊加合成，最終實現多重免疫熒光染色。完整的循環免疫熒光染色流程見圖1。

圖1 循環免疫熒光染色流程圖

2 結果

2.1 KMnO4/H2SO4/NaBH4洗脫抗體、淬滅熒光并保留抗原活性的有效性為驗證KMnO4/H2SO4/NaBH4洗脫抗體的有效性，第一輪使用兔單克隆抗體ER在乳腺癌組織上進行免疫熒光染色，結果發現染色明顯(圖2A)，經KMnO4/H2SO4/NaBH4處理后，只用熒光標記的二抗染色，未見任何ER染色，表明一、二抗已完全剝離(圖2B)。再用ER抗體和熒光標記二抗進行新一輪染色，又可以看到明顯的ER染色(圖2C)。為進一步測試抗原的穩定性，實驗進行了5輪的ER循環染色，ER免疫反應性在經過5輪的染色和洗脫后依然同第一輪染色一樣強烈，染色未見明顯減弱(圖2D)。表明該方法至少可以進行5輪染色。

ABCD

2.2 免疫熒光染色與抗體洗脫結合熒光掃描實現多重免疫熒光染色在同一張乳腺癌組織上，分別用ER、PR、HER-2、Ki-67、CK5/6進行循環免疫熒光染色，通過3D Histech Pannoramic MIDI數字切片掃描儀熒光掃描和CaseView圖像軟件對齊疊加后，可在一張乳腺癌組織切片上完美呈現5種蛋白的共表達(圖3)，這為觀察不同蛋白間的相互作用、腫瘤異質性分析、細胞表型統計、腫瘤微環境呈現等提供了極大的便利。

圖3 同一張圖片上實現5種蛋白共同標記，免疫熒光染色：ER為紫色；PR為紅色；HER-2為黃色；Ki-67為綠色；CK5/6為青色；DAPI為藍色

3 討論

免疫熒光是一項被廣泛用于腫瘤研究的技術，傳統的多重免疫熒光染色通常只能顯示2～3種抗原標記，并且要求使用不同種屬來源的一抗和二抗，以避免抗體間的交叉反應[6-8]。當需要在一張切片上顯示5種以上抗原標記時，傳統的多重免疫熒光無法顯現。酪胺信號放大免疫熒光利用酪胺分子與其結合的抗原蛋白之間共價鍵的穩定性，其鍵能遠高于抗原、抗體間的非共價鍵結合力，熒光標記后通過微波加熱法在保留抗原標記信號的同時去除結合在抗原上的一抗和二抗分子，解決了傳統多重免疫熒光抗體交叉反應的問題[9]；缺點是需要多種不同熒光素標記的酪胺信號放大試劑，配備激光掃描共聚焦顯微鏡和專業的多光譜成像設備，1次最多只能標記7種顯色，步驟多，繁瑣且耗時。對于大多數研究者來說試劑成本高，且缺乏專業設備，無法自行開展。循環免疫熒光法使用化學試劑去除每一輪樣本中的抗體和熒光染料，結合數字切片掃描儀，只需要1～2種熒光二抗試劑即可完成多重免疫熒光標記。利用雞尾酒式抗體孵育，每一輪可以顯示1～2種抗原標記，抗原在經過5輪顯色和洗脫后依然可以完好保留。因此，使用該方法經過5輪顯色后，可以實現5～10種抗原標記，且步驟簡單，耗時少，1天內即可完成。全波片熒光掃描的使用大大簡化了循環免疫熒光染色方法，其提供了所有標記的永久存檔，并允許在各種放大倍數下觀察每個標記的任何區域。更少的二抗試劑和大多數實驗室都配有的數字切片掃描儀，使得該方法具有更好的簡易性、經濟性和普及性。

綜上所述，本研究建立的循環免疫熒光法(第一輪免疫熒光染色-偽彩掃描-化學洗脫-重復免疫熒光染色-圖像合成)可以實現5～10種蛋白共染，該方法將有助于轉化醫學研究、腫瘤信號通路研究以及腫瘤微環境研究等。