膀胱尿路上皮癌中LC3B與SQSTM1的表達(dá)及其臨床意義

徐芳華，巢海潮，鄧?yán)缀?/p>

自噬(autophagy)又稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是指細(xì)胞利用溶酶體降解自身大分子物質(zhì)和Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡受損細(xì)胞器獲得存活所需的營(yíng)養(yǎng)和能量物質(zhì)的生物學(xué)過程[1]。在正常生理情況下，細(xì)胞自噬有利于機(jī)體保持自穩(wěn)狀態(tài)[2]。近年研究表明，自噬在腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用[3]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β(microtubule-associated protein 1 light chain 3β, LC3B)及選擇性自噬接頭蛋白1(sequestosome 1， SQSTM1)是自噬形成的關(guān)鍵蛋白。本文通過免疫組化MaxVision法檢測(cè)LC3B與SQSTM1在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)，分析LC3B與SQSTM1表達(dá)與膀胱尿路上皮癌臨床病理特征的關(guān)系，旨在為膀胱尿路上皮癌的診斷和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2018年12月南方醫(yī)科大學(xué)附屬萍鄉(xiāng)醫(yī)院收治的行膀胱尿路上皮癌根治術(shù)患者的石蠟標(biāo)本48例及癌旁正常膀胱組織石蠟標(biāo)本7例。其中男性45例，女性10例，平均年齡(61.4±7.5)歲。納入患者臨床資料均完整，均經(jīng)病理學(xué)確診為膀胱尿路上皮癌，術(shù)前均未行放療、免疫因子等治療。采用WHO(2016)泌尿系統(tǒng)及男性生殖器官分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)膀胱尿路上皮癌進(jìn)行病理學(xué)分級(jí)[4]：低級(jí)別尿路上皮癌15例，高級(jí)別尿路上皮癌33例。收集48例膀胱尿路上皮癌患者的臨床資料并對(duì)患者進(jìn)行隨訪。

1.2 方法組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。兔抗人LC3B單克隆、SQSTM1多克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司，工作濃度1 ∶200；蘇木精和即用型快捷免疫組化MaxVision法檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司。采用MaxVision快速免疫組化法染色。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判讀LC3B與SQSTM1免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞為黃色或棕色，均定位于細(xì)胞質(zhì)。(1)根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。(2)根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘作為最終得分：0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為()，9～12分為()，其中≤4分為低表達(dá)，>4分為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 膀胱尿路上皮癌及正常組織中LC3B與SQSTM1的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，LC3B在膀胱尿路上皮癌組織的陽性率為93.75%(45/48)，在膀胱正常組織中的陽性率為14.28%(1/7)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.187，P<0.01)；SQSTM1在膀胱尿路上皮癌組織中的陽性率為81.25%(39/48)，在膀胱正常組織中的陽性率為0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.850，P<0.01，圖1)。

圖1 LC3B與SQSTM1在不同尿路上皮中的表達(dá)，MaxVision法

2.2 膀胱尿路上皮癌中LC3B與SQSTM1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系膀胱尿路上皮癌組織中，LC3B表達(dá)與患者性別、年齡、TNM分期及腫瘤分化程度均無相關(guān)性(P均>0.05)；SQSTM1表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度顯著相關(guān)(χ2=13.05，P=0.000 3；χ2=5.035，P=0.025；χ2=11.161，P=0.000 8，表1)。

表1 膀胱尿路上皮癌中LC3B與SQSTM1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 LC3B、SQSTM1表達(dá)與膀胱尿路上皮癌患者生存期的關(guān)系采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，分析LC3B、SQSTM1表達(dá)與膀胱尿路上皮癌患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明LC3B強(qiáng)陽性組患者的總生存期(overallsurvival, OS)低于弱陽性～中等陽性組患者(χ2=10.05，P=0.001 5)；SQSTM1強(qiáng)陽性患者的OS也低于弱陽性～中等陽性組患者(χ2=11.1，P=0.000 9)。上述結(jié)果提示LC3B與SQSTM1在膀胱尿路上皮癌中強(qiáng)陽性預(yù)示患者預(yù)后不良(圖2)。

圖2 LC3B和SQSTM1表達(dá)對(duì)膀胱尿路上皮癌患者術(shù)后5年總生存率的影響：A.LC3B；B.SQSTM1

3 討論

近年一種新的程序性細(xì)胞死亡方式——自噬性程序性細(xì)胞死亡，吸引了越來越多細(xì)胞生物學(xué)家的注意。研究發(fā)現(xiàn)，在一些惡性腫瘤細(xì)胞中，自噬作為細(xì)胞對(duì)代謝壓力的適應(yīng)性反應(yīng)過程，發(fā)揮著尤為關(guān)鍵的作用[5]。

哺乳動(dòng)物中LC3包括LC3A、LC3B和LC3C三種亞型，LC3主要定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬小體的形成，是作為診斷自噬活動(dòng)的金標(biāo)準(zhǔn)之一[6]。LC3的生物學(xué)功能是在自噬發(fā)生過程中，LC3蛋白合成后被具有蛋白內(nèi)切酶活性的Atg4所剪切，生成細(xì)胞質(zhì)定位的LC3-Ⅰ。隨后LC3-Ⅰ通過Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系反應(yīng)，生成LC3-Ⅱ，并定位附著到自噬小體膜上，從而參與細(xì)胞自噬的發(fā)生[8-9]。LC3B作為L(zhǎng)C3的一種，同樣可以用作自噬的分子標(biāo)志物[10]。眭怡群等[11]研究發(fā)現(xiàn)，LC3和Beclin 1蛋白高表達(dá)胰腺癌患者的預(yù)后更差。SQSTM1同樣是經(jīng)典的自噬相關(guān)蛋白之一，也稱為p62蛋白，可作為支架蛋白參與體內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，進(jìn)而在細(xì)胞中發(fā)揮自噬與凋亡的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)SQSTM1可作為反映自噬活性的標(biāo)記蛋白，SQSTM1通過連接LC3的底物被整合到自噬小體中；當(dāng)發(fā)生細(xì)胞自噬時(shí)，自噬體與溶酶體相互融合逐漸形成自噬溶酶體后，囊泡內(nèi)的SQSTM1蛋白或細(xì)胞器被溶酶體酶降解，從而引起SQSTM1水平降低；當(dāng)細(xì)胞自噬被抑制時(shí)，SQSTM1水平升高[13]。近年來諸多研究表明，自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常膀胱黏膜組織相比，膀胱尿路上皮癌組織中LC3B和SQSTM1顯著高表達(dá)。SQSTM1表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度顯著相關(guān)。說明SQSTM1與膀胱尿路上皮癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)，SQSTM1可能作為癌基因參與了膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展。越來越多的研究表明自噬相關(guān)蛋白可作為腫瘤預(yù)后的預(yù)測(cè)分子。Ieni等[16]發(fā)現(xiàn)胃腺癌組織中LC3A/B、Beclin 1和Ambra1高表達(dá)患者的預(yù)后較差，表明自噬相關(guān)蛋白可能是晚期胃癌潛在的預(yù)測(cè)因子。本研究通過Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，LC3B和SQSTM1高表達(dá)組患者的OS均顯著低于低表達(dá)組患者，提示LC3B與SQSTM1在膀胱尿路上皮癌中高表達(dá)患者的預(yù)后不良。

綜上所述，LC3B和SQSTM1提示自噬與膀胱尿路上皮癌的預(yù)后相關(guān)，LC3B和SQSTM1可作為判斷膀胱尿路上皮癌臨床預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。