前列腺癌中PCDH9表達缺失在抑制細胞凋亡、促進腫瘤進展中的作用

龍瓊先，伍 季，彭 勇，張旭乾，廖文華

國際癌癥研究中心(IARC)的GLOBOCAN數據庫顯示，2020年前列腺癌新發病例1 414 259例，死亡病例375 304例，是全球第四大常見癌癥和男性第二大常見癌癥[1]。原鈣黏蛋白9(protocadherin 9, PCDH9)屬于非聚集型原鈣黏蛋白家族，與已證實的抑癌基因PCDH8、PCDH17、PCDH20同位于染色體13q21，可介導細胞間的黏附作用，以及調節多種效應分子，其表達缺失可引起腫瘤增殖甚至轉移[2]。現有研究顯示，PCDH9在多種實體腫瘤(如膠質細胞瘤、胃癌、肝癌)組織中表達下降，且與腫瘤惡性程度及患者預后密切相關。一項研究對65例未經治療的中國前列腺癌患者及良性配對組織進行了全基因組和轉錄組測序，發現前列腺癌組織中存在PCDH9缺失，其可以作為一個新的潛在的前列腺癌抑制基因[3]。然而，PCDH9缺失對抑制前列腺癌細胞凋亡、促進腫瘤細胞浸潤和轉移的影響報道甚少，其在前列腺癌發生、發展中的作用機制仍不清楚。本實驗分析PCDH9在調控前列腺癌細胞周期中的作用，探討其表達缺失在抑制前列腺癌細胞凋亡、促進浸潤和轉移中的分子機制，為明確前列腺癌的發生、發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018～2020年南充市中心醫院存檔的92例前列腺癌、36例良性前列腺石蠟包埋組織，所有組織常規HE染色后均經2位以上病理專家診斷。92例前列腺癌患者年齡48～87歲，平均(64.33±5.46)歲。按照2016版前列腺癌WHO/ISUP分級分組系統將前列腺癌分為1～5個組別：1組8例，2組15例，3組17例，4組21例，5組31例。術前PSA≤20 ng/mL 23例，>20 ng/mL 69例。所有患者均行手術切除治療，患者術前均未行放、化療或抗雄激素等治療。

1.2 主要試劑PCDH9兔抗人抗體購自Abcam公司，STAT3、Cyclin D1和C-myc抗體均購自福州邁新公司；免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新公司。

1.3 免疫組化取石蠟包埋組織蠟塊3 μm厚連續切片，常規脫蠟至水。Multimer標記兩步法檢測，由全自動多功能病理檢測系統(Benchmark GX，羅氏公司)按步驟操作。基本條件設定為：抗原修復30 min，用緩沖液沖洗，加入UV DAB inhibitor(Ultraview Universal DAB Detection Kit，羅氏公司)，37 ℃ 4 min。緩沖液沖洗，添加一抗(PCDH9、Cyclin D1和C-myc)，37 ℃ 30 min。緩沖液沖洗，加UV HRP multimer(Ultraview Universal DAB Detection Kit，羅氏公司)，37 ℃ 8 min。緩沖液沖洗，加入等體積的DAB和DAB H2O2(Ultraview Universal DAB Detection Kit，羅氏公司)，37 ℃ 8 min。緩沖液沖洗，加入UV copper(DAB試劑盒內)，37 ℃ 4 min。緩沖液沖洗，蘇木精Ⅱ核復染，37 ℃ 8 min。用緩沖液沖洗，加入Bluing Reagent，37 ℃ 4 min，緩沖液沖洗，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷組織切片由2名病理醫師重復觀察，隨機選取5個高倍鏡視野，按陽性細胞百分比計分：無陽性細胞為0分，陽性細胞數≤10%為1分，11%～25%為2分，26%～50%為3分，51%～100%為4分；按陽性染色強度計分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分相加作為最終評分：≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.5 統計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。樣本率的比較應用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 前列腺癌組織和良性前列腺組織中PCDH9的表達PCDH9陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于細胞質。PCDH9蛋白在前列腺癌組織中低表達，陽性率為72.8%(67/92)，顯著低于良性前列腺癌組織(100%)，差異有統計學意義(χ2=12.157，P<0.001)(圖1A～C)。

2.2 前列腺癌組織中PCDH9與Cyclin D1、C-myc表達的相關性前列腺癌組織中細胞周期調控基因Cyclin D1的陽性率為68.5%(63/92)(圖1D)，C-myc的陽性率為64.1%(59/92)(圖1E)，與良性前列腺組織相比，差異均有統計學意義(P<0.05)。63例Cyclin D1陽性前列腺癌組織中25例存在PCDH9蛋白表達缺失，25例PCDH9表達缺失病例中均存在C-myc蛋白過表達。同時Spearman檢驗分析前列腺癌組織中PCDH9表達與Cyclin D1、C-myc的表達呈負相關(r值分別為-0.414、-0.457，P<0.01)，差異有統計學意義(表1)。

表1 前列腺癌組織中PCDH9與Cyclin D1、C-myc表達的相關性

2.3 前列腺癌組織中PCDH9與STAT3表達的相關性STAT3陽性主要位于細胞核，其在前列腺癌組織中高表達，陽性率為82.6%(76/92)(圖1F))，76例STAT3陽性的前列腺癌組織中24例存在PCDH9蛋白表達缺失，Spearman檢驗分析顯示，前列腺癌組織中PCDH9的表達與STAT3的表達呈負相關(r=-0.216，P<0.05)，差異有統計學意義(表2)。

ABCDEF

表2 前列腺癌組織中PCDH9與STAT3表達的相關性

2.4 前列腺癌組織中PCDH9、STAT3表達與臨床病理特征的關系分析前列腺癌組織中PCDH9、STAT3蛋白表達與臨床病理特征的關系，發現在高WHO/ISUP分級分組、PSA>20 ng/mL及Ⅲ+Ⅳ期前列腺癌組織中PCDH9的陽性率顯著降低(P<0.01)，PCDH9表達與患者年齡、脈管神經侵犯無關(P>0.05)。前列腺癌組織中STAT3表達與WHO/ISUP分級分組、PSA水平相關(P<0.05)，在WHO/ISUP分級分組5組、PSA>20 ng/mL組中，STAT3的陽性率最高，而不同年齡、有無脈管神經侵犯及不同臨床分期組間的表達差異無統計學意義(P>0.05，表3)。>

表3 前列腺癌組織中PCDH9、STAT3的表達與臨床病理特征的關系

3 討論

近年來，中國男性前列腺癌的發病率逐漸升高，尤其是70歲以上的老年患者，嚴重影響了老年男性的生活及健康[4]。早期前列腺癌缺乏特異的臨床癥狀，發病較為隱匿，臨床上主要表現為尿頻、尿急、夜尿增多、尿流細弱，與前列腺增生癥狀類似；當出現明顯的癥狀時，疾病多已發展至中晚期[5]，易發生骨轉移，臨床上多數患者初診時即失去了根治性治療的機會。因此，探究中國前列腺癌的發生、發展機制，對前列腺癌的早預防、早診斷及早治療具有重要的意義。

PCDH9屬于非集簇原鈣黏蛋白家族，可介導細胞間的黏附作用和調節多種效應分子，其表達缺失可引起腫瘤增殖甚至轉移[2]。Wang等[6]在膠質母細胞瘤中觀察到PCDH9表達下調，而PCDH9的外源表達可以抑制腫瘤細胞的遷移。PCDH9可以通過激活GSK-3β信號并抑制轉錄因子Snail1的表達來抑制肝細胞肝癌細胞的上皮-間質轉化和細胞遷移[7]。另有研究發現miR-200a-3p在卵巢癌中表達上調，過表達的miR-200a-3p通過靶向PCDH9促進卵巢癌細胞的增殖[8]。上述研究提示惡性腫瘤中存在PCDH9表達缺失，且與腫瘤細胞增殖密切相關。本實驗發現前列腺癌組織中PCDH9的缺失率為27.2%，與良性前列腺組織相比，其表達下調差異有統計學意義。同時，PCDH9表達與前列腺癌的分級分組、臨床分期和PSA水平等預后指標密切相關。Zhang等[9]檢測了24例前列腺癌和對應正常組織中PCDH9的表達，結果亦發現前列腺癌組織中PCDH9的表達低于正常組織。究其腫瘤組織中PCDH9表達缺失的原因，有研究發現肝癌細胞中不僅存在PCDH9的雜合性缺失，而且還存在DNA甲基化[10]；而在膠質母細胞瘤中miR-215-5p可以通過結合其啟動子和3′UTR來抑制PCDH9的表達[11]。除了miRNA靶向PCDH9 mRNA影響蛋白表達，蛋白-蛋白相互作用也可能造成PCDH9表達缺失。最近有研究顯示前列腺癌細胞中PCDH9表達下調導致AKT磷酸化和活性增加，PCDH9在轉錄后受piR-001773和piR-017184調控，進一步揭示了前列腺癌中PCDH9表達下調的意義[9]。

上述研究結果顯示，前列腺癌組織中存在PCDH9表達下調，但其在抑制細胞凋亡、促進腫瘤細胞浸潤、轉移中的具體作用機制仍不清楚。STAT3是一種特殊的轉錄因子，多種惡性腫瘤細胞中都存在異常信號轉導和STAT3的異常激活[12-13]。STAT3表達上調可誘導腫瘤細胞的增殖，而其下調可以促進腫瘤細胞凋亡，其是激活多種生長因子或細胞因子信號通路上的關鍵點。目前，已鑒定出許多STAT3的靶基因，包括編碼抗凋亡基因BCL-x和MCL-1，細胞周期調控基因Cyclin D1和C-myc，以及促血管發生因子VEGF。Cyclin D1基因的擴增、染色體重排或轉錄后調節均可導致其蛋白過表達而使細胞發生癌變，STAT3可能通過調節Cyclin D1的轉錄使細胞周期發生紊亂，進而導致細胞發生惡性轉化[14]。同時，STAT3通過SH2結構域與Src結合，激活C-myc基因并上調Cyclin D1的表達，促進細胞進入細胞周期[15]。Cyclin D1在正常組織中表達量較少甚至不表達，在多數惡性腫瘤中過表達。Li等[16]研究發現，卵巢癌中Cyclin D1表達顯著高于良性卵巢腫瘤，其表達與腫瘤分級、FIGO分期、T分期和淋巴結轉移有關，且Cyclin D1陽性組的LVD計數高于Cyclin D1陰性組。C-myc已經被證明在多種人類癌癥組織中呈高表達，并且與腫瘤的發生、發展有關[17]。當染色體易位或信號通路基因突變等情況發生時，C-myc會發生不依賴于生長因子刺激的擴增，導致不受控制的細胞增殖和腫瘤產生[18]。本實驗進一步探討了STAT3信號通路在介導前列腺癌中PCDH9表達缺失、抑制腫瘤細胞凋亡和促進腫瘤進展中的作用。本實驗亦發現前列腺癌組織中Cyclin D1、C-myc的表達明顯高于良性前列腺組織，且隨腫瘤分級分組、臨床分期的增高而增高，與前列腺癌患者的預后有著密切關系。PCDH9與Cyclin D1、C-myc表達的相關性分析結果顯示，前列腺癌組織中PCDH9表達下調與細胞周期相關蛋白Cyclin D1和C-myc過表達密切相關，PCDH9表達缺失率隨著Cyclin D1和C-myc過表達率增高而增高，PCDH9表達缺失病例常存在Cyclin D1和C-myc的過表達，提示前列腺癌組織中PCDH9表達缺失可能會引起腫瘤細胞周期紊亂，導致腫瘤細胞的失控性生長。為此，本實驗繼續觀察了前列腺癌組織中STAT3的表達，并分析了PCDH9表達下調與STAT3表達上調的關系，結果顯示PCDH9表達缺失病例中存在STAT3的過表達，進一步提示STAT3信號通路在介導前列腺癌中PCDH9表達缺失、抑制腫瘤細胞凋亡和促進腫瘤進展中具有重要的作用。

綜上所述，本實驗結果表明，在前列腺癌的發生、發展過程中可能存在PCDH9的表達缺失，其作用機制可能是STAT3信號通路介導，通過調節細胞周期蛋白，進而促進腫瘤細胞的增殖，PCDH9可能成為進展期前列腺癌治療的一個潛在新靶點。