Hsf1通過HSP70-TLR4-MyD88信號通路調控腎臟AA淀粉變

夏順杰，李釗希，王琨璐，張彩妮，董愛彤，王宇彬，劉 巍，錢金澤

淀粉樣變是一組由遺傳變性和感染等不同因素引起的，因蛋白質分子錯誤折疊/異常聚集所致的淀粉樣物質沉積的綜合征[1]。AA淀粉樣變的形成主要與長期炎癥刺激所致的持續性高濃度的淀粉樣前體蛋白，即血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A, SAA)有關。大量的SAA可以通過酶解作用分解，或以錯誤折疊的方式形成具有β折疊(β-pleated sheets)的淀粉樣纖維。臨床上AA淀粉樣變的腎臟累及率高達75%～90%，預后較差，患者多死于腎功能衰竭，其發病及防治機制尚未完全清楚。

具有分子伴侶功能的熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)通過誘發熱休克反應激活熱休克轉錄因子1(heat shock factor 1, Hsf1)，參與蛋白質的正確折疊、聚合、轉運和信號傳遞等生理過程[2]。在急性腎損傷模型中，腎臟上皮細胞的Toll-like受體(toll-like receptor, TLR)，特別是TLR2和TLR4表達量明顯增加，而這兩種受體的激活是依賴于HSP70來完成的，并且在整個免疫過程中對細胞因子的介導和吞噬細胞的活化也發揮了關鍵作用[3]。TLR4是一種模式識別受體，與相應的配體結合后，TLR4被活化。其活化后可誘導多種促炎細胞因子的產生和釋放，發揮抗炎、自身免疫等效應。

前期的基因芯片篩選結果顯示，HSP70誘導促炎因子的產生與TLR4信號通路有關，而目前對于該通路在AA淀粉樣變中的作用機制尚未見詳細報道。本實驗采用Hsf1基因敲除小鼠構建腎臟AA淀粉樣變模型，探討HSP70-TLR4-MyD88通路相關因子在腎臟AA淀粉樣變中的作用機制以及Hsf1基因對其通路的調節，有助于該病在臨床上的預防與治療策略的合理選擇。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組本實驗選用ICR背景的Hsf1基因敲除鼠，由日本山口大學大學院醫學系研究科醫化學系中井彰教授贈予。所用小鼠均為2個月齡雄鼠，實驗分5組：Hsf1+/+生理鹽水組、Hsf1+/+淀粉樣變誘導組、Hsf1-/-生理鹽水組、Hsf1-/-淀粉樣變誘導組、Hsf1-/-淀粉樣變誘導同時給予替普瑞酮(GGA)治療組(Hsf1-/-淀粉樣變誘導+GCA組)，每組各6只。

1.2 模型制備根據Pras法，從AA淀粉樣變誘導的野生型小鼠腎臟組織中提取出AA淀粉樣纖維種子，各淀粉樣變誘導組采用尾靜脈注射AA淀粉樣纖維(1 μg/100 μL)，并給予皮下注射0.5 mL 1%AgNO3的方法制備AA淀粉樣變模型，然后每隔1天皮下注射0.5 mL 1%AgNO3持續誘導炎癥刺激。此外，GGA治療組每日灌胃(500 mg/kg GGA，GGA溶于4.0 mL 0.9%NaCl溶液中使用[4-5])。誘導實驗進行1周后完成造模。實驗中每天同一時間點對各組小鼠進行尾靜脈取血，并低速離心收集血清以測量SAA。

1.3 組織取材淀粉樣變誘導1周后進行取材，再使用乙醚麻醉后處死小鼠，取小鼠腎臟部分置入液氮，部分置于10%中性福爾馬林與4%多聚甲醛配置成的固定液中，室溫固定進行形態學實驗。其余部分直接冷凍于-80 ℃進行分子生物學實驗。

1.4 分子生物學實驗(1)應用RT-PCR法檢測各組中HSP70、TLR4、MyD88、Tnf-α及IL-6 mRNA檢測：從腎臟組織提取RNA合成cDNA，使用Taq DNA Polymerase進行擴增。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ進行實時定量檢測，操作系統選擇Mx 3005 RT-PCR SYSTEM。(2)應用Western blot法檢測各組小鼠腎臟中HSP70以及血清中SAA蛋白表達：使用SDS-PAGE電泳分離，轉膜后檢測蛋白表達，所用抗體HSP70和小鼠淀粉樣蛋白A(mouse amyloid A, mAA)稀釋比均為1 ∶3 000。

1.5 HE及免疫組化用10%中性福爾馬林固定取材的腎臟組織，再將其進行包埋封蠟至成型，對腎臟組織進行石蠟切片，4 ℃保存。對切片進行剛果紅染色，偏光鏡下觀察染色情況，確定淀粉樣物質的沉積程度；同時對相同部位連續切片進行免疫組化SP法染色，mAA抗體稀釋比為1 ∶3 000，在顯微鏡下觀察切片并判斷mAA沉積情況。

1.6 統計學分析所有數據使用Stat View software package(Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA)進行統計學分析，并應用Mann-WhitneyU進行數據的組間比較，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AA淀粉樣變中Hsf1對HSP70與TLR4的影響RT-PCR檢測各組腎臟中mRNA的結果顯示：淀粉樣變誘導試驗后，Hsf1+/+小鼠腎臟HSP70 mRNA表達量顯著升高，而Hsf1-/-小鼠腎臟組織HSP70 mRNA表達量無明顯改變(圖1A)，提示Hsf1表達缺失不能有效激活HSP70。此外，Hsf1-/-淀粉樣變誘導組小鼠腎臟組織中TLR4及其下游因子MyD88的mRNA表達量顯著高于Hsf1+/+淀粉樣變誘導組小鼠，并且前者的細胞因子Tnf-α和IL-6的mRNA表達量同樣顯著高于后者(圖1B～E)。結果提示，Hsf1表達缺失對HSP70-TLR4通路有直接調控作用，并影響AA淀粉樣變。

圖1 各組小鼠腎臟組織中HSP70(A)、TLR4(B)、MyD88(C)、Tnf-α(D)和IL-6(E) mRNA的表達情況

2.2 Hsf1表達缺失對炎癥刺激后SAA表達的影響通過Western blot法對各實驗組小鼠血清中SAA蛋白的表達進行檢測發現，未進行炎癥刺激時，無論是Hsf1+/+型小鼠還是Hsf1-/-型小鼠，均未檢測到血清中SAA表達；而進行炎癥刺激后，Hsf1+/+型小鼠和Hsf1-/-型小鼠血清中SAA表達均急劇升高，Hsf1-/-型小鼠血清中SAA表達量顯著高于Hsf1+/+型小鼠(P<0.05)，且在炎癥刺激后第一天達到峰值后迅速下降(圖2)。由此可見，Hsf1的缺失顯著增強了炎癥刺激后SAA的表達，為AA淀粉樣物質的形成提供了必要條件。

圖2 各實驗組小鼠每天同一時間點血清中SAA蛋白表達情況：Hsf1-/-淀粉樣變誘導組與Hsf1+/+淀粉樣變誘導組相比，*P<0.05

2.3 Hsf1敲除對AA淀粉樣物質沉積程度的影響對各組小鼠腎臟切片進行剛果紅染色結果顯示：Hsf1-/-淀粉樣變誘導組淀粉樣物質沉積顯著多于Hsf1+/+淀粉樣變誘導組，且淀粉樣物質沉積部位主要集中在集合管的間質組織中，再對相同部位連續切片進行mAA免疫組化染色，可見在熒光位置出現等量的淀粉樣沉積，證明剛果紅染色所見淀粉樣物質即為AA淀粉樣纖維(圖3)。同時利用淀粉樣蛋白沉積指數評估將淀粉樣變沉積程度進行量化比較，結果提示：Hsf1的敲除顯著增強了腎臟組織中AA淀粉樣變的沉積程度(圖4)。

ABCDEFGHHsf1+/+生理鹽水組Hsf1+/+淀粉樣變誘導組Hsf1-/-生理鹽水組Hsf1-/-淀粉樣變誘導組

圖4 小鼠腎臟組織中淀粉樣蛋白沉積指數評估：N.D.未檢出

2.4 GGA通過TLR4通路有效改善了腎臟組織中AA淀粉樣物質沉積Hsf1-/-淀粉樣變誘導組同時給予GGA處理后，結果顯示在Hsf1缺失情況下，GGA可有效的誘導腎臟組織中HSP70的mRNA和蛋白表達(圖5A、B)，同時削弱TLR4-MyD88的活化和促炎因子的表達(圖5C～F)；并且在一定程度上抑制了腎臟組織中淀粉樣物質沉積(圖6)。

圖5 GGA處理后腎臟組織中各分子mRNA和蛋白表達情況：A、B.實驗組小鼠腎臟組織中HSP70 mRNA(A)及蛋白(B)表達水平；C～F.分別為各實驗組小鼠腎臟組織中TLR4(C)、Myd-88(D)及促炎因子Tnf-α(E)和IL-6(F)的mRNA表達水平

圖6 GGA處理后腎臟組織中淀粉樣變沉積程度評估：N.D.未檢出

3 討論

AA淀粉樣變又稱繼發性系統性淀粉樣變或反應性淀粉樣變，是常見的系統性淀粉樣變性之一，由SAA形成的淀粉樣纖維(amyloid fibrils)沉積于機體組織器官內，從而引起的系統性淀粉樣變。目前，已有30余種不同的蛋白質及其前體可以引起機體的淀粉樣變疾病，如朊病毒疾病、阿爾茨海默病、Ⅱ型糖尿病、反應性淀粉樣變性疾病(reactive amyloidosis)等。簡言之，淀粉樣變是一種淀粉樣蛋白在組織或器官內沉積而引發的一組疾病，可累及全身各組織或器官，腎臟是淀粉樣蛋白常累及的器官之一，是誘發腎臟纖維化和功能異常的主要因素之一[6]。根據流行病學調查結果顯示，淀粉樣變性每年發病率約為0.7/10萬人，其中腎臟淀粉樣變的年發病率高達(0.21～0.33)/10萬人，占繼發性腎臟疾病的3.6%，以中老年患者為主。目前普遍認為，血清中SAA的含量和炎癥反應均與AA淀粉樣變的形成密切相關，特別是IL-6抑制劑可使患者血清中SAA水平正常化，達到治療AA淀粉樣變的效果[7]。

未折疊蛋白質反應(unfolded protein response, UPR)以及熱休克反應(heat shock response, HSR)，這兩種通路被認為與蛋白質折疊的動態平衡或蛋白質穩態有一定的相關性。HSR是當細胞或組織暴露在高溫、毒物、自由基、感染、淀粉樣纖維蛋白的異常沉積等應激原作用下，導致蛋白質構象改變、聚合等一系列防御適應性反應。Hsf1作為HSPs的主要轉錄因子，隨著年齡的增長其表達逐漸下降。而各種具有分子伴侶功能的HSPs通過誘發HSR激活Hsf1而被誘發出來，作為分子伴侶參與蛋白質的正確折疊、聚合、轉運等生理過程。大量體內、外實驗發現，HSP70等HSPs的高表達不僅可以有效地抑制亨廷頓病和多聚谷氨酰胺病，還可以有效抑制由α-Synuclein引起的帕金森病[8-10]。在阿爾茨海默病的研究中發現，HSP70不僅可以抑制細胞內Aβ42的異常聚集，還與細胞外淀粉樣物質的沉積密切相關[11]。此外，研究發現HSP無論在天然免疫還是獲得性免疫反應中都發揮了至關重要的作用。其中，HSP70具有免疫保護功能，可與NF-κB、MMPs、ROS等促炎因子相互作用，發揮抗炎作用。在巨噬細胞中，HSP70的上調有效地阻止了脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)所致的炎癥細胞因子如Tnf-α、IL-1β、IL-6的表達增加；在腦出血模型中，HSP70的上調降低了Tnf-α的表達，減弱了血腦屏障的破壞、水腫的形成和神經功能障礙。TLR4作為一種模式識別受體，其不僅可通過識別LPS等病原相關分子模式(pathogene-associated molecular patterns, PAMP)而被活化，還可通過高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1, HMGB1)、HSPs等損傷相關分子模式(damageassociated molecular patterns, DAMP)而被活化，從而誘導IL-1β、Tnf-α、IL-6等促炎細胞因子的產生和釋放，發揮抗炎、自身免疫等效應。根據動物和臨床研究發現，TLR4的下調顯著削弱了1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydrophridine, MPTP)誘導的帕金森小鼠腦部的神經炎癥，減少促炎因子Tnf-α和IL-1β的表達[12]。通過藥理學阻斷TLR4受體信號轉導，可以顯著削弱阿爾茨海默病中神經元胞質中的Ca2+濃度，防止細胞凋亡[13]。此外，細胞外HSP70通過TLR4與巨噬細胞、小膠質細胞、樹突狀細胞相互作用參與先天免疫應答[14]。因此，HSP70不僅參與了腎臟正常生理活動，而且在急性腎損傷、腎缺血再灌注損傷、慢性腎損傷等過程中發揮重要的保護作用。

本實驗通過采用Hsf1-/-型小鼠構建腎臟AA淀粉樣變模型，證實Hsf1的缺失不能有效誘導腎臟HSP70的表達，加劇了TLR4相關的炎癥反應，促進了促炎因子的釋放；另一方面，Hsf1的缺失導致了急性炎癥后血清中SAA高表達，從而為AA淀粉樣變沉積程度的加劇增加了可能性。作為HSP70誘導劑使用的GGA，可以有效的增加腎臟HSP70的表達來削弱TLR4介導的促炎反應，達到了一定的治療效果。

綜上所述，本實驗揭示了Hsf1通過HSP70-TLR4-MyD88信號通路調控腎臟AA淀粉變的機制，為探討腎臟AA淀粉樣變的形成機制提供了新的科學依據，并為臨床預防和治療提供了新思路。