透明細胞腎細胞癌中Sema4D的表達及臨床意義

許競澤，楊天宇，鈕 慧，婁曉莉，沈珊珊，張永勝

腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的發病率占成人惡性腫瘤的2%～3%，占腎臟惡性腫瘤的90%以上，是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一[1]。透明細胞腎細胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)是RCC常見的組織學類型之一，占RCC的70%～80%。與其它泌尿系統腫瘤不同，ccRCC對放療和化療均不敏感，因此大部分腫瘤通過手術方式進行切除。然而，約30%的ccRCC患者在初診時已發生不同程度的擴散或轉移，20%～40%患者術后仍會復發，且復發者預后較差[2]。因此，尋找可靠的預后指標及有效的治療靶點對提高ccRCC患者的生存率和生活質量至關重要。Semaphorin 4D(Sema4D)是信號素Semaphorins家族成員之一。Sema4D在免疫調節、軸突引導、血管生成、骨重塑、腫瘤遷移和侵襲等方面發揮重要作用。目前，Sema4D在ccRCC中表達的相關研究較少。因此，本文旨在探討Sema4D在ccRCC中的表達意義，為ccRCC患者的預后評估提供新的指標。

1 材料與方法

1.1 材料收集2009年10月～2019年7月蘇州大學附屬第二醫院存檔的手術切除的ccRCC標本285例及癌旁正常腎臟組織標本253例作為對照。納入標準：(1)由兩名有經驗的病理醫師均確診為ccRCC；(2)臨床資料完整。排除標準：(1)合并其它器官惡性腫瘤；(2)術前接受放療和化療等相關治療；(3)有遺傳性家族病史。285例ccRCC中，男性194例，女性91例。年齡21～88歲，平均58.6歲，中位年齡60歲，其中≥60歲147例，<60歲138例。腫瘤直徑≥5 cm 100例，<5 cm 185例。根據2009年美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer, AJCC)第七版分期標準：TNM分期Ⅰ+Ⅱ期272例，Ⅲ+Ⅳ期13例。按照ISUP/WHO核分級將病例分為1～4級，其中193例為低分級(1～2級)，80例為高分級(3～4級)。本實驗獲得蘇州大學附屬第二醫院醫學倫理委員會的批準，該實驗經患者同意并簽署知情同意書。隨訪截至2021年3月，隨訪時間1～129個月，中位時間51個月。

1.2 免疫組化采用免疫組化EnVision兩步法染色檢測Sema4D蛋白在ccRCC組織中的表達。按細胞著色強度計分：無陽性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞所占百分比計分：陽性細胞數≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～74%為3分，≥75%為4分。將兩項計分結果相加作為最終結果：0～2分為低表達，≥3分為高表達。

1.3 qRT-PCR采用Trizol試劑盒提取ccRCC和癌旁正常組織總RNA，并逆轉錄成cDNA。利用qRT-PCR法檢測Sema4D基因表達。Sema4D引物序列：上游5′-AAGCAGCATGAGGTGTATTGG-3′，下游5′-AGTTGAGGCACTCTGTCTGTT-3′。內參β-actin引物序列：上游5′-CACCATTGGCAATGAGCGGT TCC-3′，下游5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 10 s、63 ℃ 30 s，合計40個循環，PCR反應結束后分析溶解曲線，每個組織樣本設3個復孔，按照2-ΔΔCt計算基因的相對表達量。

1.4 GEPIA數據庫分析采用GEPIA數據庫(http://gepia cancer-pku.cn/)分析523例ccRCC組織中Sema4D mRNA的表達與患者總生存時間和無瘤生存時間的關聯性。

1.5 統計學分析應用SPSS 25.0軟件對所有數據進行統計學分析。采用χ2檢驗分析比較ccRCC中Sema4D表達與臨床病理特征的關系。配對資料的比較采用配對t檢驗，利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法比較組間的生存差異。應用Prism 7.0軟件繪制生存曲線。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ccRCC和癌旁正常組織中Sema4D蛋白的表達285例ccRCC組織中，Sema4D高表達89例(31.2%)，低表達196例(68.8%)(圖1A～D)；在253例癌旁正常組織中，高表達219例(86.6%)(圖1E)，低表達34例(13.4%)，差異有統計學意義(χ2=167.664，P<0.001)。

2.2 ccRCC中Sema4D的表達與臨床病理特征的關系Sema4D蛋白表達與ccRCC的ISUP/WHO核分級(χ2=7.262，P=0.007)和脈管轉移(χ2=4.066，P=0.044)有關；與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤發生部位、TNM分期等無關(P>0.05，表1)。

表1 透明細胞腎細胞癌中Sema4D表達與臨床病理特征的關系

2.3 ccRCC和癌旁正常組織中Sema4D mRNA的表達qRT-PCR檢測20對ccRCC組織和癌旁正常組織結果顯示，Sema4D mRNA相對表達量在ccRCC組織中為0.013 2±0.002 9，在癌旁正常組織中為0.031 5±0.004 1，差異有統計學意義(t=3.807，P=0.001)，表明Sema4D mRNA在ccRCC組織中表達下調。

ABCDE圖1 Sema4D蛋白在不同級別透明細胞腎細胞癌組織及癌旁正常組織中的表達,En-Vision法:A.ISUP/WHO 1級呈高表達,評分4分;B.ISUP/WHO 2級呈低表達,評分2分;C.ISUP/WHO 3級呈低表達,評分2分;D.ISUP/WHO 4級呈低表達,評分0分;E.癌旁正常組織呈高表達,評分6分

2.4 Sema4D表達與ccRCC患者預后的關系利用GEPIA數據庫對Sema4D基因與ccRCC患者生存期的關聯性進行分析，結果顯示，Sema4D基因高表達ccRCC患者的無瘤生存時間(P=0.000 52)和總生存時間(P=0.001 6)均高于Sema4D基因低表達ccRCC患者(圖2A、B)，提示Sema4D基因高表達與ccRCC患者的預后良好密切相關。同時，收集207例ccRCC患者的隨訪資料進行生存分析，結果顯示，ccRCC中Sema4D蛋白高表達組患者的生存時間高于低表達組(χ2=3.868，P=0.049，圖2C)，提示Sema4D蛋白低表達與較差的預后相關。

圖2 A. Sema4D mRNA表達與透明細胞腎細胞癌患者無瘤生存時間的關系；B. Sema4D mRNA表達與透明細胞腎細胞癌患者總生存時間的關系；C. 透明細胞腎細胞癌中Sema4D高表達組和低表達組患者生存曲線

3 討論

Sema4D又稱CD100，屬于Semaphorins信號素家族Ⅳ類成員。Semaphorins家族是一類具有高度保守結構的分泌蛋白和跨膜蛋白分子家族，其N端有一由500個氨基酸殘基構成的Semaphorins結構域和下游的叢狀蛋白-信號素-整合素結構域(plexin-semaphorin-integrin, PSI)，這一特征結構與信號素的活性有關，并在一定程度上決定了受體結合的特異性[3]。根據Semaphorin分子結構的不同，可分為8個家族亞族：無脊椎動物種屬中的Semaphorin蛋白為Ⅰ、Ⅱ類，脊椎動物種屬中的Semaphorin蛋白為Ⅲ～Ⅷ類，非神經來源的病毒種屬中的Semaphorin蛋白屬于Ⅷ類[4]。Sema4D蛋白主要以同源二聚體膜結合糖蛋白形式存在，在炎癥和腫瘤發生時也可從細胞表面釋放，以可溶性蛋白形式存在[5]。Sema4D可通過結合叢狀蛋白Plexin-B1、Plexin-B2和CD72等受體發揮血管生成、免疫調節、軸突引導等生理功能。Plexin-B1受體是Sema4D親和力最高的受體，其主要分布于內皮細胞和上皮細胞，Sema4D的可溶性胞外結構域與Plexin-B1結合并激活酪氨酸激酶受體Met和相關的巨噬細胞刺激蛋白受體Ron，從而促進血管形成，促進腫瘤細胞的遷移、侵襲等生物學過程[6]。Sema4D是人類免疫系統中第一個被發現的信號素，CD72分子主要表達于抗原呈遞細胞，如B細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞等，是B細胞的負向調控因子。Sema4D可誘導CD72分子的酪氨酸去磷酸化，導致酪氨酸磷酸酶SHP-1從CD72胞質區尾部分離，從而關閉CD72的負調控作用，誘導B細胞的增殖、活化[7]。

多項研究表明，Sema4D在癌癥中可能扮演著雙重角色。Sema4D和Plexin-B1在多種癌癥中表達上調，如前列腺癌[8]、乳腺癌[9]、卵巢上皮細胞癌[10]、頭頸部鱗狀細胞癌[11]等。Conrotto等[12]發現了Sema4D可作為一種促血管生成因子，介導Plexin-B1與Met酪氨酸激酶受體結合，從而促進血管生成。Lu等[13]研究發現Sema4D也能在膀胱癌中作為關鍵因子，通過激活PI3K/AKT通路導致腫瘤細胞增殖和轉移。已有研究證明，破骨細胞可產生Sema4D，其與成骨細胞上的Plexin-B1受體結合，抑制成骨細胞運動以及隨后獲得產生新骨的能力[14]。Yang等[15]進一步發現，乳腺癌細胞過表達Sema4D分子，其能夠誘導成骨細胞產生IL-8并刺激破骨細胞生成，從而促進乳腺癌的溶解性骨轉移。Sema4D還可通過影響腫瘤微環境(包括血管、免疫細胞、成纖維細胞、細胞外基質)，廣泛參與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和免疫逃逸。Wu等[6]發現Sema4D通過抑制單核細胞遷移和促進單核細胞向M2型巨噬細胞分化來調控腫瘤微環境，而M2型巨噬細胞可作為腫瘤啟動子。另一方面，腫瘤相關巨噬細胞(tumour-associated macrophages, TAM)通過蛋白酶裂解膜結合Sema4D，使其以可溶性形式釋放，從而允許Sema4D作用于局部和遠處的腫瘤微環境[16]，使腫瘤細胞誘導血管生成成為可能。然而，Lu等[17]發現Sema4D在嫌色性腎細胞癌、ccRCC和甲狀腺癌中的表達下降，且在包括膀胱癌、ccRCC、黑色素瘤和胸腺瘤等實體腫瘤中，Sema4D高表達與更長的總生存時間相關。此外，該研究還發現，Sema4D表達與各種腫瘤的免疫浸潤水平及多種免疫標志物呈正相關，如在包括ccRCC、黑色素瘤和胸腺瘤在內的大多數腫瘤中，Sema4D表達與CD8+T細胞、CD4+T細胞、B細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞呈正相關，TAM標志物如CCL2、CD86和IL10均與Sema4D高表達顯著相關，提示Smea4D可能參與腫瘤的免疫調節。Sema4D和Plexin-B1也可在乳腺癌中作為抑癌因子發揮作用。Malik等[18]研究發現，與無瘤生存的患者相比，乳腺癌局部復發患者的Sema4D、Plexin-B1和Plexin-B2表達降低，且Sema4D下調與更差的無瘤生存時間有關(中位生存時間111.6個月，95%CI=96.5～126.7)。進一步研究發現，ER可能參與調節信號素和叢狀蛋白的表達：與ERα陰性患者相比，ERα陽性患者的Sema4D和Plexin-B1表達增加。另外，Gómez等[19]研究發現Plexin-B1在ccRCC中的表達也下降。qRT-PCR實驗結果表明，與癌旁正常組織相比，ccRCC組織中Plexin-B1 mRNA表達水平下降達2～6倍。免疫組化顯示209例ccRCC組織中Plexin-B1的陽性率為19.1%，而在所有正常腎組織中均陽性。細胞增殖實驗進一步發現，轉染Plexin-B1載體的細胞增殖率明顯低于對照組ACHN細胞系。總之，Plexin-B1可能作為抑癌因子，通過抑制ccRCC細胞的增殖來發揮抑癌功能。本實驗通過qRT-PCR和免疫組化檢測Sema4D基因和蛋白在ccRCC組織中的表達，結果表明，與癌旁正常組織相比，Sema4D基因和蛋白表達均降低。進一步研究發現，Sema4D蛋白表達與ccRCC的ISUP/WHO分級和脈管轉移有關。生存分析發現，ccRCC中Sema4D蛋白高表達組患者的生存時間長于低表達組；同時GEPIA在線數據結果表明，Sema4D基因高表達ccRCC患者的無瘤生存期和總生存期均高于低表達患者，以上結果提示Sema4D蛋白與ccRCC的發生、發展密切相關，并可能成為ccRCC潛在的治療靶點，為ccRCC患者的預后評估提供重要指標。

綜上所述，Sema4D在許多實體腫瘤中表達上調，而本研究發現Sema4D基因和蛋白在ccRCC組織中表達下降，且與ccRCC的ISUP/WHO分級和脈管轉移相關，其生物學機制相關報道仍少見，這也為我們未來的研究指明了新的方向。鑒于Sema4D蛋白在腫瘤發生、發展中的重要作用，相信隨著對其作用機制研究的不斷深入，其有望在腫瘤的治療上成為新的有效靶點。