肝細胞癌中NCAPD2的表達及臨床意義

劉 穎，徐 然，王姝昊，白麗娜，林貞花，樸紅心

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的發病率和病死率均較高，占全世界癌癥發生率的7%[1]。由于HCC發病的高隱匿性、高轉移性，且缺乏有效的早期診斷標志物，HCC患者的5年生存率僅17%～20%[2-3]。因此，探尋新的潛在新型生物學標志物對于HCC患者的早期診斷及分子靶向治療具有重要意義。

凝縮蛋白復合物在真核生物染色體凝縮過程中發揮重要作用，在脊椎動物中有兩種凝縮蛋白復合物，分別為凝縮蛋白復合物Ⅰ及凝縮蛋白復合物Ⅱ[4]。凝縮蛋白復合物Ⅰ主要定位在細胞質，染色體凝縮蛋白復合物Ⅰ的亞基D2(non-SMC condensinⅠcomplex subunit D2, NCAPD2)屬于其亞基之一，位于染色體12p13.31[5-6]，介導復合體在染色質上的募集和定位，主要參與細胞周期過程中染色體的凝集和分離[7]。有報道稱，在果蠅中人為干擾NCAPD2的表達會影響其它凝縮蛋白亞基在染色體上的正常定位，從而影響細胞有絲分裂進程[8-9]。近年研究顯示，NCAPD2在多種惡性腫瘤中異常高表達且發揮重要作用，NCAPD2異常表達與前列腺癌細胞遷移、侵襲及周期轉變的分子機制密切相關。此外相關報道發現NCAPD2蛋白高表達與結直腸癌臨床分期和分化程度呈正相關，提示患者的不良預后。然而，NCAPD2與HCC演進之間的關系尚未見報道。本文旨在應用數據庫及免疫組化法檢測NCAPD2在正常肝組織和HCC組織中的差異表達，并探討其表達與HCC臨床病理特征的關系，為尋找新的HCC診治及預后的分子標志物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 70例HCC組織和20例正常肝組織標本芯片，購自上海芯超生物公司。70例HCC中，男性66例，女性4例；年齡<60歲者62例，≥60歲者8例；腫瘤直徑<3.0 cm者44例，≥3.0 cm者26例；有淋巴結轉移者2例，無淋巴結轉移者68例；分化程度：高分化4例，中分化41例，低分化25例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期10例，Ⅲ+Ⅳ期60例。

1.1.2主要試劑 NCAPD2抗體購自中國Abcam公司，免疫組化SP兩步法試劑盒、檸檬酸緩沖液、PBS緩沖液、DAB顯色劑和蘇木精染料，均購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化SP兩步法檢測NCAPD2蛋白表達。4 μm厚切片，60 ℃烤片40～60 min，二甲苯進行常規脫蠟，梯度乙醇水化，微波爐加熱檸檬酸鹽緩沖液4～8 min進行抗原修復，滴加一抗NCAPD2(1 ∶75)，4 ℃孵育過夜。次日滴加二抗，DAB顯色，蘇木精對比染色，中性樹膠封固。為證明NCAPD2抗體免疫組化檢測的特異性，選用NCAPD2陽性染色切片作為陽性對照，以PBS代替一抗的染色結果作為陰性對照。

1.2.2結果判斷 NCAPD2陽性染色評分標準以著色強度及著色細胞數綜合判斷。(1)按陽性細胞著色強度計分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按細胞陽性細胞數計分：陽性細胞數0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分相乘作為最終評分：0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～7分為中度陽性()，≥8分為強陽性()。

1.3 生信分析應用UALCAN數據庫(https://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析HCC組織和正常組織中NCAPD2 mRNA的表達及其與臨床病理特征的相關性。應用GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn)和Oncolnc數據庫(http://www.oncolnc.org)分析NCAPD2蛋白與HCC患者生存期的相關性。應用GO富集功能分析NCAPD2參與的生物學進程。STRING數據庫(https://string.db.org)分析NCAPD2蛋白相互作用的網絡。

1.4 統計學分析采用SPSS 22.0軟件和GraphPad Prism 7.0軟件進行統計學分析；NCAPD2蛋白表達與HCC臨床病理特征的相關性分析采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗法；運用GEPIA數據庫進行生存分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC組織中NCAPD2 mRNA的表達通過UALCAN數據庫分析371例HCC組織和50例正常組織中NCAPD2 mRNA的表達，結果顯示：與正常組織相比，HCC組織中NCAPD2 mRNA的表達水平顯著上調(P<0.01，圖1A)。進一步分析NCAPD2 mRNA表達與HCC臨床病理特征的相關性發現，其與HCC組織學分級、臨床分期和TP53突變密切相關(P<0.01)。NCAPD2 mRNA隨著HCC組織學分級降低，其表達水平逐漸上調(P<0.01，圖1B)；與正常組織相比，NCAPD2 mRNA在不同分期HCC組織中的表達水平均明顯增強，且隨臨床分期呈升高趨勢(P<0.01，圖1C)，但臨床分期Ⅳ除外。與正常組織和TP53未突變HCC組織相比，NCAPD2 mRNA表達水平在TP53突變HCC組織中異常高表達(P<0.01，圖1D)，提示NCAPD2表達與HCC的惡性程度和TP53基因突變呈正相關。

圖1 UALCAN數據庫分析NCAPD2 mRNA在肝細胞癌組織中的表達水平：A.NCAPD2 mRNA在正常肝組織和肝癌組織中的表達；B.NCAPD2 mRNA表達與組織學分級的關系；C.NCAPD2 mRNA表達與臨床分期的關系；D.NCAPD2 mRNA表達與TP53基因突變的關系

2.2 HCC組織中NCAPD2蛋白的表達免疫組化結果顯示，NCAPD2蛋白主要定位于細胞質，少量表達于細胞核，其在正常組織中呈陰性或低表達，在HCC組織中呈陽性或強陽性(圖2)。在70例HCC組織中，NCAPD2蛋白的陽性率(77.1%，54/70)和強陽性率(51.4%，36/70)均顯著高于癌旁正常組織(45.0%和25.0%，P<0.01，表1)。

表1 正常組織和肝細胞癌組織中NCAPD2蛋白的表達

ABCD

2.3 NCAPD2蛋白與HCC臨床病理特征的相關性通過分析NCAPD2表達與HCC臨床病理特征的相關性發現，NCAPD2表達與HCC組織學分級和臨床分期顯著相關(P<0.05)，而與HCC患者性別、年齡、淋巴結轉移等無明顯相關性(P>0.05，表2)，與UALCAN數據庫檢索結果相一致。其中，NCAPD2在低分化組織中的強陽性率(84.0%，21/25)明顯高于中分化(78.0%，32/41)和高分化組織(25.0%，1/4)(P<0.05)；NCAPD2蛋白在臨床分期Ⅲ+Ⅳ期HCC組織中的強陽性率(75.0%，45/60)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期HCC組織(40.0%，4/10)(P<0.05)。上述結果提示：NCAPD2蛋白可能參與HCC的惡性演進。

表2 NCAPD2蛋白表達與肝細胞癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.4 NCAPD2表達與HCC患者預后的關系應用GEPIA數據庫分析NCAPD2表達與HCC患者預后的關系發現，NCAPD2高表達患者的總生存期和無瘤生存期明顯短于低表達患者，差異具有統計學意義(P<0.05，圖3A、B)；Oncolnc數據庫分析結果與之相符，NCAPD2高表達預示HCC患者較差的生存期(P<0.05，圖3C、D)。上述結果提示：NCAPD2高表達與患者的不良預后呈正相關。

圖3 NCAPD2表達與肝細胞癌患者生存期的相關性：A.GEPIA數據庫顯示NCAPD2蛋白高表達者的總生存率均低于NCAPD2蛋白低表達者；B.GEPIA數據庫顯示NCAPD2蛋白高表達者的無瘤生存率低于NCAPD2蛋白低表達者；C、D.Oncolnc生存曲線分析顯示NCAPD2蛋白高表達者的總生存率(C)和疾病特異生存率(D)均低于NCAPD2蛋白低表達者

2.5 NCAPD2參與的生物學功能及蛋白互作進程GO富集分析顯示，NCAPD2主要參與細胞分裂、細胞周期、蛋白質定位和細胞增殖等生物學功能(圖4A)。進一步通過STRING數據庫檢索發現，NCAPD2的互作蛋白主要為細胞增殖相關蛋白SMC2、SMC4、CDK1和CDC5L等(圖4B)。提示NCAPD2可能通過調控細胞增殖影響腫瘤的惡性演進。

圖4 A.GO富集分析顯示NCAPD2蛋白參與的細胞生物學功能；B.STRING數據庫顯示NCAPD2蛋白與相關蛋白的互作進程

3 討論

NCAPD2在淋巴結、骨髓、脂肪等組織中普遍表達，組成凝縮蛋白復合物的亞基在細胞中表達異常均與癌癥的發生有關。研究發現，NCAPD2在非小細胞肺癌組織中異常高表達，且與肺癌患者臨床預后不良呈正相關。冷紅等[10]的研究揭示，NCAPD2可促進乳腺癌細胞生長，與乳腺腫瘤分級及乳腺癌內分泌治療等密切相關。王玉等[11]的研究結果亦證實，NCAPD2高表達能夠促進胃癌的增殖、侵襲和遷移，與胃癌的發展呈正相關。以上研究結果均提示，NCAPD2與腫瘤的發生、發展密切相關，其有望成為治療癌癥的新靶標。

本實驗評估了NCAPD2表達與HCC之間的相關性。UALCAN數據庫檢索發現，NCAPD2 mRNA表達在HCC中顯著增強，其高表達與HCC臨床分期、組織學分級呈顯著正相關(P<0.05)，提示NCAPD2在HCC的惡性演進中扮演著重要角色。數據庫分析亦發現，NCAPD2表達與TP53基因突變存在明顯相關性(P<0.05)，且TP53突變的腫瘤表現為細胞周期相關基因和蛋白的表達增強[12]，提示NCAPD2可能與HCC的細胞周期進程存在互作關系。進一步免疫組化染色結果與UALCAN數據庫檢索結果一致，NCAPD2蛋白在HCC組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織，并與HCC組織學分級和臨床分期密切相關(P<0.05)。國內匡滿超[13]的研究結果與之相符合，其研究顯示NCAPD2在乳腺癌組織中高表達，且與乳腺癌組織學分級、臨床分期等病理參數關系密切。提示NCAPD2可能在HCC的惡性演進中發揮重要的促癌作用。此外，探究NCAPD2蛋白表達與HCC患者預后的關系發現，NCAPD2高表達HCC患者的總生存期及無瘤生存期更短。這與文獻報道相一致，NCAPD2高表達與結直腸癌患者的預后不良密切相關。提示NCAPD2蛋白高表達可能是判斷HCC不良預后的潛在分子標志物。

眾所周知，腫瘤的惡性演進離不開細胞異常增殖和細胞周期的失衡。有關NCAPD2的研究證實，其可通過激活mTORC1加快細胞周期轉變，抑制細胞自噬，進而促進結直腸癌細胞生長[14]。本組對NCAPD2的生物學功能進行探究，GO富集分析顯示，NCAPD2參與細胞周期、細胞增殖和細胞有絲分裂等多種生物學功能；進一步STRING數據庫分析蛋白互作關系發現，NCAPD2的互作蛋白主要集中于細胞周期進程相關蛋白(CDK1、SMC2、SMC4等)。上述研究結果提示，NCAPD2可能通過調控細胞周期促進HCC的生長，但其具體分子機制仍有待進一步分析。

綜上所述，本實驗證實NCAPD2表達上調提示HCC患者預后不良，且NCAPD2表達與HCC的惡性程度呈正相關，可作為評估HCC患者病情進展及預后的依據之一，有望成為HCC診斷和預后的新分子靶標。但本研究仍存在不足之處：本次實驗納入的樣本量較少，需要擴大樣本量進行驗證；對于NCAPD2調控HCC的分子機制僅限于數據庫檢索，并未涉及具體的細胞功能實驗，仍有待后續深入闡釋。