胰腺癌組織中THBS2的表達及臨床意義

夏 雨，祝成樓，邱志勝，徐 雷，達明緒,

胰腺癌是一種惡性程度極高、療效差和早期診斷率較低的常見消化系統惡性腫瘤，90%以上的胰腺癌為胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)，其發病率和病死率在全球范圍內均呈遞增趨勢，嚴重危害人類健康[1]。大多數胰腺癌患者在確診時已處于疾病晚期階段，5年總生存率小于7%[2]。因此，探索新的胰腺癌早期診斷分子標志物，將有利于提高胰腺癌的早期診斷及早期治療，對胰腺癌患者預后改善亦至關重要。

血小板反應蛋白-2(thrombospondin-2, THBS2)屬于細胞外基質糖蛋白家族成員，由多種類型細胞包括間質成纖維細胞、內皮細胞和免疫細胞等釋放，可介導細胞外基質的組裝，細胞與細胞外基質的相互作用，基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的降解，以及抑制血管生成[3]。有研究顯示，THBS2是一種與PDAC有關的標志物蛋白，在PDAC患者血清中高表達，與CA-199聯合檢測，對早期胰腺癌的診斷特異度可提升至98%，靈敏度提升至87%[4]。目前THBS2在胰腺癌組織中的表達尚未見相關報道。本實驗通過探討THBS2在PDAC組織中的表達，并分析其表達與臨床病理特征及預后的關系，以期為胰腺癌的治療及預后評估提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料收集甘肅省人民醫院2015年3月～2021年3月經手術切除且經病理確診的PDAC及相應癌旁正常組織蠟塊69例。其中男性48例，女性21例，患者年齡30～82歲，中位年齡61歲。胰腺癌臨床分期參照第8版美國腫瘤聯合委員會(American Joint Committee on Cancer， AJCC)pTNM標準進行。納入標準：(1)病理診斷為PDAC；(2)無合并其他良性或惡性腫瘤；(3)術前未經放、化療；(4)無其他全身系統性疾病。排除標準：(1)合并有其他良性或惡性腫瘤；(2)臨床病理資料信息不全。

1.2 免疫組化手術切除標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后進行連續切片。一抗THBS2(1 ∶50)兔多克隆抗體、二抗及二氨基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB)購自上海艾博抗公司。免疫組化染色采用EliVision法，具體實驗步驟嚴格按照EliVision Plus檢測試劑盒說明書進行。

1.3 結果判定在雙盲條件下，由2名病理科主任醫師獨立評估每個標本的染色評分結果。在高倍鏡(400×)下隨機選取5個染色組織視野，根據細胞染色強度進行評分：無陽性著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分；按陽性細胞百分數評分：≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。將兩項評分相乘作為最終評分：<3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 數據庫分析應用GEPIA數據庫分析比較胰腺癌組織[num(T)179例]和癌旁正常組織[num(N)171例]中THBS2的表達水平(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene)，P<0.01為差異有統計學意義。采用包括風險比(HR)和95%CI在內的Kaplan-Meier在線生存分析軟件(https://kmplot.com/analysis/)分析THBS2表達和PDAC患者總生存期的關系，P<0.05為差異有統計學意義。

1.5 統計學分析應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，運用χ2檢驗或Fisher精確概率法來分析THBS2表達與PDAC臨床病理特征的關系。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PDAC組織和癌旁正常組織中THBS2的表達免疫組化結果顯示，THBS2表達主要定位于細胞質(圖1)。69例PDAC組織中，45例THBS2陽性，陽性率為65.2%，癌旁正常組織中25例THBS2陽性，陽性率為36.2%，兩組間差異有統計學意義(χ2=11.597，P<0.05，圖1)。

ABCD

2.2 THBS2表達與PDAC臨床病理特征的關系THBS2表達與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑、是否血管侵犯均無相關性(P>0.05)；THBS2表達與腫瘤分化程度、臨床分期及有無淋巴結轉移密切相關(P<0.05，表1)，即腫瘤分化程度(中+低分化)較低、臨床分期(Ⅲ+Ⅳ)較晚、有淋巴結轉移者，THBS2陽性率更高。

表1 胰腺導管腺癌中THBS2表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 THBS2表達與患者總生存期的關系通過GEPIA發現，胰腺癌組織中THBS2表達水平顯著高于癌旁正常組織(P<0.01，圖2)。利用Kaplan Meier-plotter在線生存分析軟件分析發現，隨著時間推移，THBS2表達差異患者的生存率逐漸呈現顯著差異，THBS2高表達患者的總生存期遠低于THBS2低表達患者(HR=1.57，P<0.05，圖3)。

圖2 GEPIA在線分析TCGA數據庫胰腺癌組織中THBS2的表達

圖3 Kaplan Meier-plotter在線生存分析軟件分析THBS2表達與胰腺癌患者總生存期的關系

3 討論

THBS家族由5種鈣結合基質細胞糖蛋白組成，即THBS1～5。依據寡聚化狀態和蛋白分子結構域不同進行劃分，可將其分成三聚體和五聚體兩大類。其中THBS1和THBS2屬三聚體蛋白，其他是五聚體[3]。THBS1和THBS2具有相似的分子結構和85%的氨基酸保守性，因此具有相似的結合域。在血小板反應蛋白家族中，只有THBS1和THBS2包含3個Ⅰ型備解素樣特殊重復序列，該序列可抑制血管生成[3]。體外實驗研究已證明，THBS2是一種抑制血管生成因子，并認為Ⅰ型結構域發揮抑制作用[5-6]。THBS2可與多種細胞膜表面受體、生長因子、細胞因子及相關蛋白酶相結合，從而發揮其調控作用，其中包括調節細胞基質黏附、運動性、趨化性、傷口愈合、血管生成抑制等[7]。THBS2主要通過抑制血管生成和負性調控MMP-2和MMP-9蛋白表達，參與腫瘤的發生、發展[8]。然而，最近相關研究表明，THBS2對腫瘤的生長和轉移具有促進作用，其有可能成為腫瘤治療的潛在分子靶點[9-12]。

有研究發現，THBS2在結直腸癌組織中高表達，在相應癌旁正常組織中低表達，差異有統計學意義，其表達水平與淋巴浸潤及TNM分期呈正相關，顯著影響患者預后[13-14]。Xu等[15]研究發現，THBS2/TLR4相互作用可上調結直腸癌細胞中糖酵解相關基因表達(GLUT1、HK2、ALDOA、PKM2、LDHA)，促進糖酵解過程，為腫瘤細胞生長供應能量，進而促進腫瘤細胞生長。THBS2是TWIST2的下游基因之一，在TWIST2轉錄調控下，miR-221-3p通過靶向調控THBS2基因序列，進而促進子宮頸癌細胞的侵襲和轉移，但具體作用機制尚不明確[11]。Weng等[9]研究發現，非小細胞肺癌組織中THBS2的表達顯著增加，且其表達與腫瘤直徑和TNM分期密切相關。在胃癌方面，THBS2在胃癌中的表達較癌旁正常組織顯著上調，提示預后不良，可作為胃癌患者預后評估指標[16]。

本實驗結果顯示，THBS2在PDAC組織中高表達，在癌旁組織中低表達。THBS2表達與腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移、TNM分期密切相關，提示THBS2表達不僅與胰腺癌的發生有關，而且與胰腺癌的惡性程度和侵襲轉移有關。本組基于GEPIA和Kaplan Meier-plotter生存分析發現，THBS2在胰腺癌組織中表達顯著高于癌旁正常組織，THBS2高表達胰腺癌患者的總生存期短于THBS2低表達者，THBS2表達與患者總生存期呈負相關。提示THBS2可作為評估胰腺癌患者預后的風險因素。

本實驗著重于探討胰腺癌組織中THBS2表達及其與臨床病理特征的關系，并未涉及其分子機制方面的研究。目前，有關THBS2在腫瘤發生發展中的分子機制研究十分有限。有研究顯示，THBS2在胰腺癌中高表達，其可能主要通過PI3K/AKT信號通路進行調節腫瘤細胞生物學功能，包括促進增殖和遠處轉移[17]。本實驗在一定程度上證明THBS2參與了胰腺癌的侵襲與轉移，且具有促進作用。然而，本實驗結果與THBS2的抗血管生成及腫瘤抑制基因作用相矛盾。由此推測，THBS2可能在腫瘤發生、發展過程中發揮著雙重作用，其可能參與了未知的調控機制，有待全面深入研究并揭示具體作用機制。

綜上所述，THBS2表達與胰腺癌的惡性程度呈正相關，且對腫瘤細胞的侵襲與轉移起促進作用，且THBS2高表達預示胰腺癌患者預后差。提示在胰腺癌的發生、發展中，THBS2發揮重要作用，有望成為胰腺癌的治療靶點及評估預后的重要指標。