結腸癌中TMCO1、CALR的表達及對轉移的影響

齊順利，趙團結，于曉倩，孫 平，劉紅剛

2020年全球癌癥統計報告指出，結直腸癌的發病率僅次于乳腺癌和肺癌，位居第3位，其病死率僅次于肺癌，位居第2位，且結腸癌的發病率和病死率呈年輕化趨勢[1-2]。雖然近年來臨床獲得大量防治結腸癌轉移的研究成果，但尋找特異性治療靶點仍是防治轉移的關鍵。

跨膜和卷曲螺旋結構域1(transmembrane and coiled-coil domains 1, TMCO1)是一種新型內質網鈣離子通道蛋白，其基因的缺失或蛋白表達異常將會引起內質網Ca2+穩態失衡和信號異常，引發內質網應激和Ca2+信號傳導紊亂，從而導致腫瘤的發生[3-4]。鈣網蛋白(calreticulin, CALR)是一種存在于內質網中高度進化保守的鈣結合蛋白，參與細胞的各種生理和病理過程。越來越多的研究發現，CALR表達與不同類型腫瘤細胞的增殖和轉移有關[5-6]。目前，TMCO1、CALR在結腸癌中的作用機制仍不清楚。本實驗擬通過人結腸癌組織標本和細胞模型，闡述TMCO1和CALR在結腸癌組織中的表達水平，以及明確TMCO1對結腸癌細胞侵襲和遷移的影響，為尋找新靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年1月～2021年1月北京市肛腸醫院存檔的59例低～中分化結腸癌根治術標本及對應的癌旁組織樣本。患者術前均未接受中醫治療、新輔助化療以及生物靶向等治療。本實驗通過北京市肛腸醫院科研倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞與試劑結直腸癌HCT116細胞株購自上海中喬新舟公司，TMCO1抗體購自武漢華美公司，CALR抗體購自武漢三鷹公司，N-cadherin、E-cadherin、β-actin抗體均購自北京博奧森公司，Lipofectamine 3000購自賽默飛世爾公司，DMEM高糖培養基、胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素溶液均購自GIBCO公司，Transwell小室購自Corning公司，vimentin、熒光二抗、免疫組化二抗均購自北京中杉金橋公司，1%結晶紫染液購自北京索萊寶公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 結腸癌和癌旁組織常規組織脫水、石蠟包埋，連續切片，脫蠟至水，EDTA(pH 8.0)抗原修復，滴加一抗TMCO1(1 ∶100)、CALR(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，滴加二抗工作液，37 ℃孵育1 h，PBS震蕩清洗3次，DAB顯色，蘇木精復染，脫水、封片，400倍光鏡下觀察蛋白表達情況。應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測量TMCO1、CALR陽性細胞的平均吸光度(A)值，以間接反映TMCO1、CALR蛋白表達量，重復3次取平均值。

1.3.2細胞培養和轉染 配置細胞完全培養基(含10%FBS、1%雙抗、DMEM高糖)，在37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養，每2～3天傳代1次。取對數生長期細胞，1×105個/孔接種于6孔板，將細胞分為對照組、Lip 3000組和TMCO1 siRNA組。當細胞融合度達70%～80%時，參照Lip 3000試劑盒說明書步驟根據實驗分組進行轉染。其中，TMCO1 siRNA序列(上游5′-GAGAUCUAUCAAUGGUUCG AATT-3′，下游5′-UUCGAACCAUUGAUAGAUCUCT T-3′)由上海生工公司合成。轉染48 h后收集所有分組細胞，Western blot法檢測TMCO1 siRNA轉染效果。

1.3.3免疫熒光 各組細胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定10 min，0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS漂洗3次，5%BSA封閉30 min，加一抗TMCO1(1 ∶100)、CALR(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗3次，避光熒光二抗孵育1 h，PBS漂洗3次，DAPI核染5 min，封固后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4Western blot法 取各組細胞，PBS沖洗2次，加入500 μL細胞裂解液，吸至離心管中，12 000 r/min離心20 min后取上清液，BCA法測定總蛋白濃度。100 ℃沸水浴5 min使蛋白變性、電泳、轉膜，10%脫脂奶粉封閉2 h，加一抗TMCO1(1 ∶500)、CALR(1 ∶1 000)、vimentin(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、N-cadherin(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶3 000)，4 ℃過夜，次日復溫1 h，加二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL暗室曝光顯影。以β-actin為內參，采用Image J圖像分析軟件進行灰度值分析，灰度值=目的條帶/β-actin。

1.3.5細胞劃痕實驗 取對數生長期細胞，按每毫升2×105個細胞，每孔500 μL細胞懸液接種于6孔板中，培養過夜，用200 μL槍頭在培養板內劃線，PBS清洗3次，加入無血清培養基，每組設3個復孔，培養48 h后在顯微鏡下觀察并拍照，利用Image J圖像分析軟件進行分析。

1.3.6Transwell檢測 細胞無血清培養24 h，胰蛋白酶消化，培養基重懸至細胞濃度為每毫升1×105個，將Transwell上室加入200 μL細胞懸液，下室加入600 μL含10%血清的完全培養基，37 ℃ 5%CO2培養48 h，4%多聚甲醛固定10 min，結晶紫染色20 min，用棉簽擦去上層細胞，隨機取中央及四周5個視野，倒置顯微鏡下觀察、拍照并計數，實驗重復3次。

1.3.7內質網紅色熒光探針檢測 去除細胞培養液，HBSS溶液洗滌，加入配置好的ER-Tracker Red工作液，37 ℃孵育15 min，細胞培養液洗滌2次，10%中性福爾馬林37 ℃固定2 min，PBS清洗3次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡下封固并觀察，實驗重復3次。

2 結果

2.1 結腸癌和癌旁組織中TMCO1、CALR蛋白的表達結腸癌組織中TMCO1和CALR蛋白表達較癌旁組織增高，差異有統計學意義(t=-8.519、-7.256，P均<0.01，圖1)。

圖1 結腸癌和癌旁組織中TMCO1、CALR蛋白表達水平：與癌旁組織相比，*P<0.05

2.2 Western blot法檢測TMCO1 siRNA干擾效果應用Western blot法檢測結腸癌HCT116細胞經TMCO1 siRNA干擾后TMCO1蛋白表達情況，與對照組相比，TMCO1 siRNA干擾組TMCO1蛋白表達水平顯著降低(F=232.118，P<0.001，圖2)。

圖2 Western blot法檢測TMCO1 siRNA干擾效果

2.3 細胞劃痕實驗檢測TMCO1對HCT116細胞遷移能力的影響對照組、Lip 3000組和TMCO1 siRNA組0 h劃痕距離差異無統計學意義(F=0.176，P>0.05)。TMCO1 siRNA組48 h劃痕距離顯著長于對照組和Lip 3000組，差異具有統計學意義(F=23.307，P<0.01，圖3)。

圖3 細胞劃痕實驗檢測TMCO1對結腸癌HCT116細胞遷移能力的影響：與對照組比較，*P<0.05；與Lip 3000組比較，#P<0.05

2.4 Transwell實驗檢測TMCO1對HCT116細胞侵襲能力的影響TMCO1 siRNA組(44.67±6.51)穿過Transwell小室的細胞數量明顯低于對照組(190.33±16.56)和Lip 3000組(184.67±14.98)，差異具有統計學意義(F=113.265，P<0.001，圖4)。

圖4 Transwell實驗檢測TMCO1對結腸癌HCT116細胞侵襲能力的影響

2.5 免疫熒光檢測HCT116細胞TMCO1、CALR蛋白表達水平與對照組和Lip 3000組相比，TMCO1 siRNA組HCT116細胞TMCO1、CALR蛋白熒光強度顯著減少，差異有統計學意義(F=153.078、153.039，P均<0.001，圖5)。

圖5 免疫熒光檢測結腸癌HCT116細胞中TMCO1、CALR蛋白表達水平：與對照組比較，*P<0.05；與Lip 3000組比較，#P<0.05

2.6 Western blot法檢測TMCO1對HCT116細胞CALR、vimentin、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達水平的影響Western blot檢測結果顯示，TMCO1 siRNA組CALR、TMCO1、vimentin、N-cadherin蛋白表達水平較對照組和Lip 3000組顯著降低，而E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，差異均有統計學意義(F=66.4396、69.806、170.146、58.713、283.747，P均<0.001，圖6)。

圖6 Western blot檢測結腸癌HCT116細胞TMCO1、CALR、vimentin、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達水平：與對照組比較，*P<0.05；與Lip 3000組比較，#P<0.05

2.7 內質網探針檢測TMCO1對HCT116細胞內質網氧化應激水平的影響TMCO1siRNA組內質網探針熒光強度較對照組和Lip 3000組顯著降低，差異有統計學意義(F=42.003，P<0.001，圖7)。

3 討論

結腸癌是我國常見的消化道腫瘤之一，結腸癌細胞的轉移和侵襲是導致我國結腸癌患者生存率低、病死率高的主要因素。所以，探索敏感性、特異性靶點成為防治結腸癌轉移的關鍵。

Ca2+作為細胞的第二信使，參與機體細胞代謝、細胞增殖和死亡、蛋白質磷酸化、神經遞質和激素釋放、基因轉錄等多種生理活動[7-8]。Ca2+濃度的異常升高可以激活癌細胞的活性，促進癌細胞的增殖和遷移[9]。TMCO1作為一種新型的內質網Ca2+通道蛋白，其基因缺失或蛋白表達異常將會引起內質網Ca2+穩態失衡和信號異常，導致腫瘤的發生。Li等[10]研究發現，TMCO1能夠通過抑制AKT信號通路抑制膀胱尿路上皮癌的增殖和遷移，表明TMCO1是新型的抑癌因子，抑制其蛋白表達可影響患者預后。Chen等[11]研究發現，TMCO1可以促進肺腺癌的侵襲和遷移，抑制TMCO1表達水平肺腺癌細胞的侵襲和遷移能力明顯受到抑制。TMCO1表達可能在不同的腫瘤和癌細胞中具有不同的功能，這可能與腫瘤細胞類型特異性差異有關。本實驗通過干擾TMCO1表達，可顯著抑制結腸癌HCT116細胞的侵襲和遷移能力，并且我們推測其可能與CALR蛋白相關。

CALR蛋白在腫瘤進展中發揮重要作用。諸多研究表明，CALR在結直腸癌、胃癌、乳腺癌中表達顯著升高，其表達水平與臨床分期和淋巴結轉移呈正相關[12-14]。Harada等[15]報道CALR高表達與口腔鱗狀細胞癌患者TNM分期、總生存率以及預后不良有關，CALR可作為衡量口腔鱗狀細胞癌預后的重要標志物。本實驗結果表明，人結腸癌組織中TMCO1、CALR蛋白表達水平顯著高于癌旁正常組織，提示TMCO1、CALR高表達可能與結腸癌的發生、發展密切相關。

為進一步驗證，本實驗檢測TMCO1對CALR表達的影響，發現TMCO1 siRNA組中CALR表達顯著降低，提示TMCO1 siRNA抑制結腸癌侵襲和遷移過程與調控CALR表達水平相關。本實驗通過內質網熒光探針發現，轉染TMCO1 siRNA可顯著降低探針強度，作者推測TMCO1可能通過調控內質網氧化應激促進結腸癌的發生。本實驗現階段并未驗證，后續將進一步深入研究。此外，本實驗亦發現干擾TMCO1表達后EMT相關標志物蛋白vimentin、N-cadherin蛋白表達水平明顯降低，而E-cadherin蛋白表達水平明顯升高。這提示，TMCO1的促癌作用可能與調控vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達有關。Chen等[11]的研究亦發現，在肺腺癌中抑制TMCO1表達，vimentin、N-cadherin表達水平明顯降低，E-cadherin表達水平明顯升高，從而導致遷移能力顯著降低，與本實驗結果一致。

綜上所述，結腸癌組織中TMCO1、CALR蛋白表達水平顯著升高。干擾TMCO1表達后，HCT116細胞侵襲和遷移能力顯著降低，其作用機制可能與CALR及內質網氧化應激水平以及EMT相關標志物蛋白顯著相關。