circHIPK3通過調控miR-124-3p/EZH2促進食管鱗狀細胞癌細胞惡性生物學行為

蘇 敏，王文祥，唐金明

食管癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，我國食管癌的發病率和病死率分別位居惡性腫瘤的第6位和第4位[1]。我國90%食管癌為食管鱗狀細胞癌，患者預后較差，5年生存率約15%[2-3]。因此，發掘食管鱗狀細胞癌潛在的治療靶點具有重要意義。環狀RNA(circular RNA, circRNA)是一種共價封閉環狀非編碼RNA，雖然難以被翻譯成蛋白質，但可以調控基因的轉錄和轉錄后修飾而發揮重要作用[4-6]。近年研究發現，circHIPK3(hsa_circ_0000284)參與多種腫瘤的發生、發展[7]，如前列腺癌[8]、乳腺癌[9]、胃癌[10]、肺癌[11]、膀胱癌[12]、結直腸癌[13]、卵巢癌[14]等。而目前circHIPK3在食管鱗狀細胞癌中的作用及機制尚不十分明確。因此，本文通過檢測circHIPK3在食管鱗狀細胞癌組織和細胞中的表達，探討circHIPK3對食管鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移等生物學功能的影響及可能的分子機制，為靶向circHIPK3治療食管鱗狀細胞癌提供依據。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集2017年5月～2018年3月湖南省腫瘤醫院行手術切除、術前未接受化療或放療患者的食管鱗狀細胞癌組織及配對癌旁組織樣本(距癌組織>3 cm)42例，樣本均經病理檢查確診。其中男性26例，女性16例；年齡47～74歲，平均(61.3±5.26)歲。本實驗經湖南省腫瘤醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗材料人正常食管上皮細胞系HET-1A及食管鱗狀細胞癌細胞系KYSE-410、KYSE-510購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，湖南省腫瘤醫院中心實驗室保存。鼠抗人EZH2單克隆抗體購自R&D Systems公司；兔抗人Actin抗體、HRP標記IgG二抗購自成都正能生物公司；轉染試劑購自上海吉凱基因科技公司；引物設計與合成由北京擎科生物公司完成；CCK-8試劑盒購自碧云天生物公司；凋亡試劑盒購自諾唯贊生物公司；Trizol試劑、qRT-PCR試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白質定量試劑盒及ECL發光試劑盒購自天根生化科技(北京)公司；Transwell小室購自美國Corning公司；RNA抽提試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養 HET-1A、KYSE-410和KYSE-510培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養液中，每隔2～3天消化傳代1次，細胞均培養于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中。

1.3.2shRNA慢病毒感染 沉默表達特異性circHIPK3病毒及陰性對照病毒由上海吉凱基因科技公司提供。應用含有針對circHIPK3特異性的shRNA慢病毒感染KYSE-410和KYSE-510細胞作為circHIPK3敲低組，陰性對照病毒感染KYSE-410和KYSE-510細胞作為對照組。

1.3.3qRT-PCR檢測 取相應的樣本組織或細胞，用Trizol或RNA抽提試劑盒提取RNA，進行定量，再按逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。circHIPK3上游引物5′-GGGTCGGCCAGTCATGTATC-3′，下游引物5′-ACACAACTGCTTGGCTCTACT-3′；EZH2上游引物5′-GCCATTATGGACATCGCGGTGC-3′，下游引物5′-CTTCGCGCTCGCGTGCCG-3′；miR-124-3p上游引物5′-GCGGCGGTAAGGCACGCGGTG-3′，下游引物5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。按qRT-PCR試劑盒說明書進行qRT-PCR定量檢測。每孔熒光信號達到閾值時經歷的循環數為Ct，采用2-ΔΔCt法計算。以GAPDH為內參檢測circHIPK3的表達，以U6為內參檢測miR-124-3p的表達。實驗均重復3次。

1.3.4Western blot法 取適量細胞，裂解提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量，調節上樣濃度。恒壓電泳，半干法轉膜，分別以抗EZH2(1 ∶1 000)和Actin抗體(1 ∶5 000)為一抗，以HRP標記IgG為二抗(1 ∶5 000)，ECL發光液顯影，凝膠成像系統拍照。

1.3.5CCK-8實驗 將細胞按1×103個/孔接種于96孔板，每組設4個復孔，培養24～96 h；于每個設定的時間點每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育1 h；酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度(OD)值。實驗重復3次。

1.3.6劃痕遷移實驗 將細胞按5×105個/孔接種于6孔板，待細胞融合度達90%時，用10 μL槍頭沿直尺垂直劃直線。劃線后用不含血清的培養基洗滌2～3次，分別于培養0 h和24 h時，顯微鏡下拍照并測量劃痕寬度。實驗重復3次。

1.3.7Transwell侵襲實驗 將BD Matrigel膠與RPMI-1640培養基按1 ∶5比例稀釋，加50 μL稀釋的Matrigel膠至Transwell小室上室。將Transwell小室放入37 ℃細胞培養箱中孵育30 min。待膠凝固后，取細胞用無血清RPMI-1640培養基調整細胞濃度至每毫升2×105個，取50 μL加至Transwell小室上室，將Transwell小室置入24孔培養板(預先加入500 μL含10%胎牛血清的1640培養基)；培養24 h后取出小室，用棉簽擦去基質膠和小室內細胞，4%多聚甲醛固定10 min，0.5%結晶紫溶液染色15 min；洗脫殘余染液，顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野計數穿膜細胞。實驗重復3次。

1.3.8Annexin V-FITC/PI凋亡實驗 將細胞接種至6孔板，培養至對數生長期后，收集細胞，PBS重懸，取(5～10)×104個重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入10 μL PI，輕輕混勻，冷浴避光放置，上流式細胞儀(BD FACSVerse)檢測。實驗重復3次。

1.3.9雙熒光素酶檢測報告實驗 將293T細胞培養于96孔板，待細胞密度達50%～70%時，將20 μL DMEM與0.16 μg circHIPK3目的質粒以及5 pmol miR-124-3p/Negative Control充分混勻，再加入0.3 μL轉染試劑充分混勻，室溫放置。在細胞中加入以上試劑，37 ℃ 5%CO2培養箱中培養。轉染6 h后換用新鮮培養基，轉染48 h后收集細胞，根據說明使用雙熒光素酶測定試劑盒檢測熒光素酶活性，使用雙熒光素酶報告分析系統檢測熒光強度。實驗重復3次。

2 結果

2.1 食管鱗狀細胞癌組織及細胞中circHIPK3的表達qRT-PCR檢測結果顯示，circHIPK3在42例食管鱗狀細胞癌組織中的表達水平顯著高于配對癌旁組織(P<0.001，圖1A)；circHIPK3在食管鱗狀細胞癌細胞中的表達量均顯著高于正常食管上皮細胞：與HET-1A細胞相比，circHIPK3在KYSE410和KYSE-510細胞中的相對表達量分別為3.06±0.47(P=0.017)和3.63±0.41(P=0.008，圖1B)。

圖1 qRT-PCR檢測circHIPK3的表達：A.食管鱗狀細胞癌組織和癌旁組織；B.食管鱗狀細胞癌細胞和食管上皮細胞；*P<0.05

2.2 敲低circHIPK3對食管鱗狀細胞癌細胞增殖和凋亡的影響qRT-PCR檢測結果顯示，circHIPK3敲低組KYSE-410和KYSE-510細胞中circHIPK3相對表達量(0.42±0.03，0.35±0.05)均明顯低于對照組(圖2)，表明sh-circHIPK3慢病毒感染能顯著抑制circHIPK3的表達。

圖2 qRT-PCR檢測sh-circHIPK3慢病毒感染食管鱗狀細胞癌細胞后circHIPK3表達量：*P<0.05

CCK-8檢測結果顯示，circHIPK3敲低組KYSE-410及KYSE-510細胞增殖能力均顯著低于對照組，48 h(P=0.014、0.046)、72 h(P=0.044、0.006)、96 h(P=0.037、0.032)差異均有統計學意義(圖3)；Annexin V-FITC/PI檢測結果顯示，circHIPK3敲低組KYSE-410和KYSE-510細胞的早期凋亡比例均高于對照組(P=0.007、0.009，圖4)。

圖3 CCK-8實驗檢測敲低circHIPK3對食管鱗狀細胞癌細胞增殖的影響：A.KYSE-410；B.KYSE-510；*P<0.05

圖4 Annexin V-FITC/PI實驗檢測敲低circHIPK3對食管鱗狀細胞癌細胞凋亡的影響：A.KYSE-410；B.KYSE-510；C.細胞早期凋亡比例統計圖；*P<0.05

2.3 敲低circHIPK3對食管鱗狀細胞癌細胞遷移及侵襲的影響劃痕實驗結果顯示，circHIPK3敲低組KYSE-410及KYSE-510細胞劃痕愈合度明顯低于對照組(P=0.013、0.004，圖5)；Transwell實驗結果顯示，circHIPK3敲低組KYSE-410和KYSE-510穿膜細胞數明顯低于對照組(P=0.004、0.006，圖6)。

圖5 劃痕實驗檢測敲低circHIPK3對食管鱗狀細胞癌細胞遷移的影響：A.KYSE-410；B.KYSE-510；C.劃痕愈合度統計圖；*P<0.05

圖6 Transwell實驗檢測敲低circHIPK3對食管鱗狀細胞癌細胞侵襲的影響：A.KYSE-410；B.KYSE-510；C.穿膜細胞數統計圖；*P<0.05

2.4 敲低circHIPK3對食管鱗狀細胞癌細胞中miR-124-3p和EZH2表達的影響為探討circHIPK3發揮作用的分子機制，本實驗應用在線數據庫預測可能與circHIPK3結合的miRNA并結合文獻報道，選擇circHIPK3/miR-124-3p/EZH2信號通路進行驗證。結果顯示，circHIPK3與miR-124-3p具有潛在的結合位點(圖7A)。對circHIPK3的相應結合位點進行突變，雙熒光素酶報告實驗驗證circHIPK3與miR-124-3p的結合關系，結果顯示miR-124-3p mimics+circHIPK3-wt組熒光素酶活性與NC mimics+circHIPK3-wt組相比，差異有統計學意義(P<0.001，圖7B)。

qRT-PCR結果顯示，與陰性對照組相比，circHIPK3敲低組KYSE-510細胞中miR-124-3p表達水平(3.21±0.49)顯著高于對照組(P=0.016，圖7C)，EZH2 mRNA表達水平(0.39±0.07)顯著下調(P=0.004，圖7D)；Western blot分析結果顯示，EZH2蛋白表達水平下降(圖7E)。

圖7 敲低circHIPK3對miR-124-3p和EZH2表達的影響：A.數據庫預測circHIPK3與miR-124-3p的結合關系；B.雙熒光素酶報告實驗驗證circHIPK3與miR-124-3p的結合關系；C.qRT-PCR檢測敲低circHIPK3對KYSE-510細胞中miR-124-3p表達的影響；D.qRT-PCR檢測敲低circHIPK3對KYSE-510細胞中EZH2 mRNA表達的影響；E.Western blot法檢測敲低circHIPK3對KYSE-510細胞中EZH2蛋白表達的影響；*P<0.05

3 討論

我國是食管癌高發國家，發病例數約占全球病例數的一半，其中90%患者為食管鱗狀細胞癌且預后不佳[2]。近年來大量研究表明，lncRNA、circRNA等非編碼RNA在多種腫瘤中表達異常，可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤發生、發展等一系列過程[5,15-17]。circRNA參與調控基因的轉錄和轉錄后修飾，可能作為腫瘤的標志物或治療靶點而受到廣泛關注[18-20]。circHIPK3來源于同源域結合蛋白激酶3(homeodomain-interacting protein kinase 3, HIPK3)基因的第二外顯子，長1 099 bp，且在多種腫瘤的進展中發揮了重要作用[21-22]。Ba等[23]報道circHIPK3在食管鱗狀細胞癌組織中高表達，且能通過調控miR-599/c-MYC信號通路促進TE-13細胞的增殖。但circHIPK3在其他食管鱗狀細胞癌細胞系中的作用和機制并不清楚，值得深入研究。

本實驗發現，circHIPK3在食管鱗狀細胞癌組織中高表達，這與Ba等[23]的研究結果一致。此外，circHIPK3在KYSE-410和KYSE-510細胞系中高表達，利用shRNA病毒感染KYSE-410和KYSE-510細胞敲低circHIPK3表達，細胞的增殖、遷移和侵襲均受到抑制，而細胞凋亡比例上升，提示circHIPK3在食管鱗狀細胞癌中可能發揮促癌作用。

研究顯示，circHIPK3大量存在于細胞胞質中，因此其可能充當miRNA的海綿，通過ceRNA機制影響miRNA靶基因的表達來發揮其調控作用[23-24]。通過生物學分析并結合文獻報道，本實驗選擇circHIPK3/miR-124-3p/EZH2信號通路進行初步驗證。文獻報道miR-124-3p在腫瘤中發揮重要作用，如miR-124-3p通過調控ITGB3抑制胃癌細胞的遷移和侵襲[25]，miR-124-3p在膀胱癌中低表達且通過調控EDNRB抑制膀胱癌細胞增殖[26]。EZH2基因位于人類染色體7q35上，可編碼一種名為組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶的生物酶，是多梳蛋白抑制復合體2(polycomb repressive complex 2, PRC2)的催化活性亞單位，參與組蛋白H3第27位賴氨酸的甲基化修飾進而抑制相關基因的轉錄[27-28]。EZH2蛋白具有促進細胞增殖和轉移、抑制細胞凋亡以及參與耐藥等功能[29-30]。本實驗結果顯示，敲低食管鱗狀細胞癌細胞中circHIPK3后，miR-124-3p表達上調，而EZH2 mRNA和蛋白表達水平均下降；熒光素酶報告基因實驗也表明，circHIPK3與miR-124-3p有直接結合作用。上述結果提示：circHIPK3可能通過影響miR-124-3p/EZH2信號軸而發揮功能。

綜上所述，本實驗結果顯示circHIPK3在食管鱗狀細胞癌中發揮促癌作用，提示circHIPK3可能是食管鱗狀細胞癌的潛在治療靶標。然而，本實驗對于circHIPK3對miR-124-3p和EZH2的直接調控作用研究尚淺，circHIPK3在食管鱗狀細胞癌中的作用機制還未得到完全驗證，本課題組將進一步對circHIPK3在食管鱗狀細胞癌中的作用及其調控機制進行深入研究，為其成為食管鱗狀細胞癌的治療靶點提供實驗依據。