Wnt/β-catenin通路相關分子在多囊卵巢綜合征患者卵巢顆粒細胞中的表達

勞凱雪 刁興華 黃 盈 劉春嬌 李清春 丁培輝 姜建喜 王雁林

濱州醫學院附屬醫院生殖醫學中心 山東 濱州 256603

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期女性常見的生殖內分泌代謝紊亂性疾病，也是導致女性排卵障礙性不孕的重要原因[1]。目前研究發現PCOS疾病是多因素共同作用的結果，包括內分泌紊亂[2]、機體慢性炎癥[3]、遺傳因素[4]以及不良心理情緒等。PCOS患者常表現為卵巢早期卵泡發育過多，但卵泡因發育停滯而無優勢卵泡形成[5]，是一種原發性的卵泡病。顆粒細胞凋亡是導致卵泡閉鎖的直接重要原因[6]，也是PCOS卵泡發育異常的重要原因之一。顆粒細胞凋亡達10 %以上的發育卵泡提示該卵泡已經或正在發生閉鎖，一旦卵泡發生閉鎖，便無法再回到正常發育軌道上[5]。

有研究證實，Wnt通路在調節卵巢發育、卵泡生長等方面都起到重要的作用[7]，尤其是Wnt/β-catenin信號通路。Wnt信號通路對胚胎期小鼠卵巢發育具有重要作用[8]，Wnt4-/-雌性小鼠卵母細胞數量急劇下降至不到10%，卵巢發育不良且生殖能力降低[9]，敲除Wnt4相關分子RSPO1可導致大多數雌性小鼠不孕[10]。運用基因芯片技術檢測發現，突變型小鼠卵巢中Wnt/β-catenin信號通路相關拮抗基因如Wif1、Nkd1以及Dkk4僅在卵泡樣病變部位的細胞中表達升高[11]，缺乏β-catenin的小鼠則卵巢發育不良[12]。前顆粒細胞的更新也依賴于支持細胞群體中的Wnt/β-catenin信號傳導[13]。Foxo3a作為叉頭框蛋白家族中的成員，可被Wnt通路激活[14]，并通過調控其下游P27、Cyclin D1、Puma、caspase3等信號分子影響顆粒細胞的增殖、凋亡功能[15-16]。本研究通過體外分離人卵巢顆粒細胞以探討Wnt/β-catenin/Foxo3a信號通路在多囊卵巢綜合征患者卵巢顆粒細胞異常中的調控機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取在我院生殖醫學中心接受體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)或卵胞漿內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)助孕治療的35例患者為研究對象。將患者分為PCOS組(20例)和對照組(15例)。PCOS組采用鹿特丹診斷標準，符合以下3項中的2項即可診斷PCOS：①稀發排卵或者無排卵;②一側或者雙側卵巢表現為多囊樣改變;③雄激素增高或者有高雄激素的臨床表現。入組患者還需排除其他疾病患者，如庫欣綜合征、先天性腎上腺皮質增生、服藥導致高雄激素血癥等。對照組為單純輸卵管性不孕且卵巢儲備功能正常的患者。

1.2 顆粒細胞的分離與純化 采用Percoll密度梯度離心法，將收集的卵泡液離心后胰酶消化5 min，PBS緩沖液洗滌，棄上清后用PBS緩沖液重懸顆粒細胞，緩慢平鋪于等體積50% Percoll液上，2 000 r/min離心20 min。吸凈白膜層，PBS緩沖液洗滌后，2 000 r/min離心5 min，棄去上清，所得沉淀即為顆粒細胞。

1.3 實時定量PCR 按照RNA-FAST試劑盒(Takara公司)說明書提取顆粒細胞總RNA，將獲得的RNA逆轉錄成cDNA。按照SYBR Green PCR試劑盒(Takara公司)說明書將cDNA、SYBR Premix Ex Taq II(2×)、引物及dH2O混合至20 μL反應體系。使用CFX 96實時定量PCR檢測儀(美國Bio-Rad公司)檢測，擴增條件為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，如此40個循環，于60℃～95℃生成溶解曲線，每個基因設置3個復孔，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗所用引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2 結果

2.1 卵巢顆粒細胞中的β-catenin、Foxo3a表達水平 本研究采用實時定量PCR技術檢測了PCOS組與對照組卵巢顆粒細胞中β-catenin、Foxo3a的表達水平，通過對比發現，與對照組相比，PCOS組的β-catenin、Foxo3a的表達水平均升高，P<0.05,見圖1。

兩組比較，*P<0.05

2.2 卵巢顆粒細胞P27、Cyclin D1表達情況 為明確Foxo3a分子在PCOS患者卵巢顆粒細胞增殖中的作用，本研究檢測了Foxo3a下游分子P27、Cyclin D1的表達水平。結果顯示，與對照組相比，PCOS組患者卵巢顆粒細胞中P27的表達水平升高，P<0.01，見圖2A，而兩組顆粒細胞的Cyclin D1表達水平差異無統計學意義，見圖2B。

兩組比較，**P<0.01

2.3 卵巢顆粒細胞中Caspase3、Caspase8表達水平 為探索PCOS卵巢顆粒細胞凋亡情況，本研究檢測了PCOS組和對照組卵巢顆粒細胞Caspase3和Caspase8的表達水平。結果顯示，與對照組相比，PCOS組的Caspase3、Caspase8表達水平均高于對照組，P<0.05，見圖3。

兩組比較，*P<0.05

3 討論

PCOS是育齡期婦女常見的內分泌紊亂性疾病，在育齡期婦女中發病率為5.6%[17]，在無排卵不孕癥女性中占60%[18]。PCOS伴隨代謝和生殖軸激素分泌的異常，為一種原發性卵泡病，卵巢顆粒細胞的異常是PCOS疾病卵泡發育異常的重要原因[19]。有研究證實，PCOS患者卵泡發育過程中存在閉鎖以及顆粒細胞層退化、變薄的情況[20]。由于卵巢顆粒細胞與卵細胞關系密切，顆粒細胞的異常可導致對卵泡細胞的營養支持、調節功能障礙，影響雌二醇、孕酮的分泌，從而對卵泡的整個發育過程造成影響[5]。

有研究證實，Wnt通路在動物生長發育、細胞代謝和干細胞維持等方面發揮著重要作用[21]， 并參與了卵巢顆粒細胞的增殖、凋亡及分泌功能的調控[15-16]。Wnt通路作為一種高度保守的信號通路，在細胞內至少有三條[22]：β-catenin途徑、平面細胞極性通路和鈣離子通路[23-24]，其中與生殖密切相關的為Wnt/β-catenin信號通路[23]。Wnt通路激活后，Wnt與受體Frizzled和LRP5/6結合，激活Dsh磷酸化，從而傳遞信號至細胞內，抑制APC、GSK-3D、Axin和β-catenin形成的復合物激酶活性，使胞質內β-catenin表達升高，向細胞核內移位，與轉錄因子TCF/LEF家族形成復合物，啟動Cyclin D1、c-myc等靶基因的轉錄，從而影響細胞功能[14]。本研究發現PCOS組卵巢顆粒細胞β-catenin分子表達升高，提示Wnt經典途徑參與了PCOS卵巢顆粒細胞異常機制的調控。有研究表明，作為叉頭框蛋白家族中成員的Foxo 3a被Wnt通路激活后能明顯促進人卵巢顆粒細胞的凋亡、抑制細胞增殖，而Wnt通路抑制劑作用效果相反[14]。Foxo3a被活化后可改變細胞核內P27和Cyclin D1的表達以調控細胞周期，抑制細胞增殖[14-15]。Foxo 3a還可通過調控前凋亡蛋白Bim、FasL、Puma等凋亡分子以激活凋亡蛋白酶Caspase3和Caspase8，導致細胞凋亡[16]。目前研究表明，細胞凋亡有兩條信號傳導途徑，包括內源性凋亡通路和外源性死亡受體通路[25-26]。本文研究發現PCOS組顆粒細胞Foxo 3a表達升高，其下游調節細胞周期的P27及凋亡相關分子Caspase3、Caspase8表達均升高，提示PCOS患者卵巢顆粒細胞增殖能力下降、外源性凋亡通路引起的凋亡增加，說明Wnt/β-catenin信號通路對Foxo 3a分子的調控能引起PCOS患者卵巢顆粒細胞增殖、凋亡異常，進而導致PCOS患者卵泡發育的異常。

綜上所述，PCOS患者卵巢顆粒細胞異常與Wnt信號通路有關，Wnt/β-catenin/Foxo 3a軸為治療PCOS疾病的潛在靶點，這將為PCOS疾病的治療提供新的理論思路。