不同方式的堿燒傷對(duì)誘導(dǎo)兔角膜新生血管生成的比較

王麗君 劉伊琳 宋 斌 孫洪坤

1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科 山東 濱州 256603；2 山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院眼科 山東 濟(jì)南 250021；3 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科 山東 濱州 256603

角膜之所以能維持透明狀態(tài)，主要取決于角膜基質(zhì)層沒(méi)有血管[1]。角膜受到創(chuàng)傷、感染及其他免疫性疾病的刺激后，角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)便會(huì)自角膜緣向角膜中央呈病理性生長(zhǎng)，進(jìn)而降低病變區(qū)域角膜的透明度，從而導(dǎo)致視力下降[2]。CNV形成的病理生理過(guò)程是非常復(fù)雜的[3]。角膜炎癥反應(yīng)是CNV形成的主要原因之一[4]。角膜堿燒傷是誘導(dǎo)CNV形成的經(jīng)典方法，其常用的燒傷部位為中央或周圍角膜[5]。但對(duì)于不同濃度的堿燒傷，其作用的部位不同來(lái)誘導(dǎo)CNV形成的成功率的比較目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將對(duì)此進(jìn)行深入探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120只純種新西蘭大白兔，購(gòu)自山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院(山東濟(jì)南)，月齡為2～3個(gè)月，體質(zhì)量為1.5～2.0 kg，雌雄不限。裂隙燈顯微鏡下排除眼前節(jié)病變。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東大學(xué)動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)號(hào)為19075。

疼痛的范圍符合分布規(guī)律,有明顯壓痛者應(yīng)進(jìn)行神經(jīng)阻滯試驗(yàn),該方法具有診斷性治療作用。此試驗(yàn)陽(yáng)性是早期診斷本病的特征表現(xiàn)之一。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用隨機(jī)抽簽法將家兔隨機(jī)分為6組，每組20只。所有家兔均選擇右眼作為堿燒傷模型，左眼作為對(duì)照眼。造模方法為選用3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg，天津金藥)行靜脈注射麻醉，愛(ài)爾凱因滴眼液行表面麻醉2次。用棉簽擦干結(jié)膜囊和角膜表面，取直徑為6 mm的圓形濾紙，置于1.0、1.5、2 mol/L的NaOH溶液中浸泡15 s，然后用干濾紙吸附濾紙中多余的液體。用0.9%生理鹽水充分沖洗結(jié)膜囊1 min。用濾紙?jiān)谝?guī)定的位置將規(guī)定濃度NaOH涂于角膜表面30 s，術(shù)后分別用氧氟沙星眼膏涂抹雙眼。各組處理如下：2M+P組將2 mol/L NaOH作用于周邊角膜(periphery cornea)的角膜緣處；2M+C組將2 mol/L NaOH作用于中央角膜(central cornea)；1.5M+P組將1.5 mol/L NaOH作用于周邊角膜的角膜緣處；1.5M+C組將1.5 mol/L NaOH作用于中央角膜；1M+P組將1 mol/L NaOH作用于周邊角膜的角膜緣處；1M+C組將1 mol/L NaOH作用于中央角膜。見(jiàn)圖1。

我跟阿花商量，別和大發(fā)廠狠了，狠不過(guò)人家的。阿花把林強(qiáng)信的祖宗八代操遍之后，說(shuō)也罷，我們自己培養(yǎng)熟手，現(xiàn)在訂單充裕了，王義山負(fù)責(zé)生產(chǎn)，你負(fù)責(zé)技術(shù)指導(dǎo)，盡快培養(yǎng)新員工。

A. 作用位置為周邊角膜，濾紙邊緣與角膜緣相切；B. 作用位置為中央角膜，濾紙作用于角膜中央。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

角膜混濁程度與NaOH濃度有關(guān)，1M+P組和1M+C組的角膜混濁程度明顯低于其他組。燒灼位置為中央角膜的各組的角膜混濁程度低于燒灼位置為周邊角膜的各組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在較高NaOH濃度(1.5、2 mol/L)的情況下，燒灼位置為周邊角膜的各組的水腫程度低于燒灼位置為中央角膜的各組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CNV模型的成功率取決于NaOH濃度及其灼燒于角膜位置。在相同NaOH濃度作用下，燒灼位置為周邊角膜的模型成功率更高，而在相同燒灼位置下，較高濃度的NaOH更容易提高CNV模型的成功率(表1)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所應(yīng)用統(tǒng)計(jì)方法包括卡方檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)、方差分析及線性相關(guān)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.2 CNV面積的測(cè)量 堿燒傷后第14天用數(shù)碼相機(jī)(Canon 5D mark 2，日本)記錄CNV形態(tài)。用image pro plus(IPP)軟件(6.0版Windows，Media Cybernetics，美國(guó))測(cè)量CNV面積與角膜潰瘍面積。模型建立失敗的標(biāo)準(zhǔn)為第5天未觀察到CNV。

2 結(jié)果

并網(wǎng)光伏發(fā)電系統(tǒng)用正弦波電壓源型逆變器結(jié)構(gòu)通常如圖1所示，主要由前級(jí)DC/DC變換器和后級(jí)DC/AC逆變器組成，其原理是根據(jù)升壓技術(shù)將低壓直流電變換成高壓直流電，然后通過(guò)逆變電路輸出220 V交流電[3]3.

所用家兔均未見(jiàn)角膜溶解與角膜穿孔。

1.3.1 角膜混濁及角膜水腫的評(píng)分 堿燒傷后第14天在裂隙燈顯微鏡下觀察角膜混濁及角膜水腫情況，采用Yoeruek等[6]的方法對(duì)每個(gè)角膜按照角膜水腫及角膜混濁的程度進(jìn)行分級(jí)。角膜混濁度分級(jí)為：0級(jí)，透明；1級(jí)，混濁極少，可清晰透見(jiàn)虹膜紋理及瞳孔；2級(jí)，輕度混濁，虹膜可見(jiàn)，但紋理不清晰；3級(jí)，中度混濁，虹膜模糊，隱約不可見(jiàn)；4級(jí)，重度混濁，虹膜及瞳孔看不清。角膜水腫分級(jí)為：0級(jí)，無(wú)水腫；1級(jí)，輕中度水腫；2級(jí)，嚴(yán)重水腫。

當(dāng)然，讀書(shū)多思，還只是一端，多思還必須求證。你的思考是否正確，還必須得到證明，這證明一是靠前輩學(xué)者研究的成果，包括古人的箋疏；二是靠你再查各種資料，包括《辭海》之類的工具書(shū)和其他可以確證的資料，決不能自以為是，只憑自己的理解，不求確證是不科學(xué)的。

表1 不同組間CNV模型的成功率比較

堿燒傷后第14天，2M+P組，2M+C組，1.5M+C組，1.5M+C組CNV的面積和角膜潰瘍的面積見(jiàn)表2。對(duì)于上述兩個(gè)指標(biāo)分別進(jìn)行單因素方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FCNV面積=16.91，PCNV面積<0.05；F角膜潰瘍面積=58.78，P角膜潰瘍面積<0.05)，而組間兩兩比較，P均<0.05。結(jié)果顯示，燒灼位置為周邊角膜時(shí)，NaOH的濃度越高，CNV的面積越大，而角膜潰瘍的面積反而越小。這一相關(guān)性也證實(shí)了CNV與角膜潰瘍面積呈相反趨勢(shì)(P<0.05，r=-0.395 1)(圖2)。

表2 堿燒傷后第14天各組CNV面積與角膜潰瘍面積比較/(n=20，cm2)

圖2 CNV的面積與角膜潰瘍面積的相關(guān)趨勢(shì)圖

3 討論

建立CNV模型的方法很多，包括燒灼法、角膜縫合法、角膜基質(zhì)生長(zhǎng)因子注射法[7-9]等。本研究通過(guò)不同濃度的NaOH作用于不同的角膜位置來(lái)誘導(dǎo)CNV形成，通過(guò)對(duì)CNV模型的成功率及角膜形態(tài)學(xué)的分析，評(píng)價(jià)模型的堿燒傷誘導(dǎo)效果。本研究表明，應(yīng)用2 mol/L的NaOH且其燒灼位置為周邊角膜是誘導(dǎo)CNV形成的最佳方法，但其作用的潛在機(jī)制尚不清楚，考慮角膜緣可能在這過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。角膜緣作為結(jié)膜與角膜之間的屏障，避免了結(jié)膜新生血管侵入角膜[10-14]。在本研究中，燒灼位置為周邊角膜的模型角膜緣損傷更嚴(yán)重，角膜的生理功能受到影響，從而導(dǎo)致角膜的生理功能受到損害，進(jìn)而對(duì)模型的干擾更大。本研究還顯示CNV的面積與NaOH的濃度呈正相關(guān)，這與以往研究[15]結(jié)果一致。

本研究還表明CNV面積與潰瘍的面積呈負(fù)相關(guān)。Kim等[16]發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)CNV形成可以使炎癥因子浸潤(rùn)于角膜潰瘍中，從而阻止角膜基質(zhì)的溶解，這是治療角膜潰瘍的重要方法。本研究揭示的CNV與角膜潰瘍的負(fù)相關(guān)關(guān)系為臨床治療化學(xué)燒傷引起的角膜潰瘍提供了依據(jù)。基于此原理，臨床上采用了一些方法，例如羊膜或球結(jié)膜覆蓋等，通過(guò)誘導(dǎo)CNV形成來(lái)預(yù)防潰瘍的發(fā)展。