低氧通過TLR2-MyD88信號通路誘導BV2細胞M1/M2型極化

許 娜 馮凌云 于 燕

1 濱州醫學院 山東 煙臺 264003;2 山東省高等學校協同創新中心(睡眠與呼吸相關疾病防治協同創新中心)

氧穩態的調節和維持在決定細胞命運方面具有重要作用。缺氧是指組織中氧氣含量低或不足，致使機體氧化應激水平增加，誘導炎癥反應，導致多個器官功能損傷，尤其是腦組織損傷。炎癥在多數情況下被認為是缺氧誘發組織損傷的病理基礎。越來越多的報道也證實，缺氧會加劇全身炎癥，引起神經炎癥和腦損傷[1]。低氧暴露會增加脂多糖(LPS)誘導的腦組織炎癥損傷[2]，并可以在短時缺氧期間促進炎癥反應加快腦水腫的發展[3]。

腦缺氧誘發炎癥反應后會即刻激活腦常駐細胞，并導致外周循環系統白細胞的浸潤。在短時間內，響應缺氧的炎癥信號是一種適應性機制，它在感染、損傷或缺氧期間能夠提高細胞存活率。然而，慢性和/或全身性嚴重缺氧可導致不良炎癥，從而加重疾病。許多實驗研究已經描述了在缺氧級聯反應的各個階段，先天免疫在腦組織損傷和修復/重塑中發揮的重要作用。

本研究主要通過CoCl2構建低氧模型，探究BV2細胞在低氧過程中向M1/M2表型的動態轉化，并驗證TLR2-MyD88信號通路在此過程中發揮的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 小鼠小膠質細胞系的BV2細胞，為實驗室留存。

1.1.2 試劑 蛋白提取試劑盒(上海Beyotime公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海Beyotime公司)；活性氧檢測試劑盒(上海Beyotime公司)；氯化鈷(II)六水合物(CoCl2·6H2O)(美國Sigma公司)；RPMI1640 (美國Hyclone公司)；HIF-1α抗體(Cell Signaling公司，36169)；TLR2抗體(Cell Signaling公司，13744)；MyD88抗體(BBI生命科學有限公司，AB21009a)；TRAF6抗體(BBI生命科學有限公司，abx129788)；IL-1β抗體(Cell Signaling公司，31202)；β-actin抗體(Cell Signaling公司，8457)；Arg1抗體(Abcam公司，ab233548)；iNOS抗體(Abcam公司，ab178945)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體(Cell Signaling公司，7074)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體(Cell Signaling公司，7076)。

1.1.3 儀器 Heracell 150i細胞培養箱(美國Thermo公司)；CKX31倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；垂直電泳儀及轉移系統(美國Bio-rad公司)；化學成像系統(Clinx Science Instrucment)；

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 小鼠BV2細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基進行培養。所有細胞在37℃、5% CO2的細胞培養瓶中培養。每3天更換1次細胞培養基，當細胞密度達到80%～90%時傳代，后續實驗選擇第4～10代。

1.2.2 低氧模型 在細胞內加入CoCl2，使其終濃度為100 μmol/L，分別處理4、6 h。

1.2.3 活性氧檢測 制備10 μmol/L的DCFH-DA工作液。將細胞提前種植于6孔板內，用PBS清洗3遍后，加入2 mL DCFH-DA工作液，在培養箱中孵育30 min，PBS清洗3次后，用熒光顯微鏡進行觀察。

1.2.4 免疫印跡法檢測 將細胞在裂解緩沖液中低溫裂解30 min后，12 000 g，離心5 min，收集上清，采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品在上樣緩沖液中稀釋，98 ℃加熱5 min，然后在凝膠上進行電泳。電泳后，將蛋白質轉移到PVDF膜上，在5%牛奶中封閉2 h，然后用TBST緩沖液洗滌3次。PVDF膜與一抗4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌，然后與二抗在室溫下孵育2 h。TBST緩沖液洗滌3次，15 min/次，使用化學發光成像系統檢測和可視化目標蛋白。

2 結果

2.1 活性氧檢測結果 將BV2細胞進行DCFH-DA(綠色)探針染色。DCFH-DA在成像前與細胞一起孵育30 min，然后用PBS沖洗。利用DCFH-DA探針檢測BV2細胞活性氧水平，結果顯示，經CoCl2低氧造模處理后，CoCl24 h組和CoCl26 h組的活性氧水平均較常氧組明顯升高，并且隨著低氧時間的延長，CoCl26 h組的活性氧水平明顯高于CoCl24 h組(圖1)。

圖1 CFH-DA探針成像圖像

2.2 低氧誘導因子(HIF-1α)蛋白表達水平的變化 BV2細胞CoCl2低氧造模后，經Western Blot技術檢測HIF-1α蛋白含量，明確造模效果。結果表明，與常氧組相比，CoCl24 h組和CoCl26 h組的HIF-1α蛋白含量均明顯升高，P<0.05(圖2)，表明細胞處于低氧狀態，CoCl2低氧造模成功。

A. Western Blot檢測BV2細胞內HIF-1α、TLR2、MyD88、TRAF6、IL-1β蛋白含量；B～F. 柱狀圖分別顯示HIF-1α/β-actin，TLR2/β-actin，MyD88/β-actin，TRAF6/β-actin，IL-1β/β-actin的比值，通過ImageJ測量其灰度值。與對照常氧組相比，#P<0.05。

2.3 TLR2/MyD88信號通路關鍵蛋白表達水平的變化 BV2細胞TLR2蛋白含量檢測結果表明，與常氧組相比，CoCl24 h組和CoCl26 h組的TLR2蛋白含量均明顯升高，P<0.05，提示BV2細胞在低氧狀態下，TLR2參與調控其低氧應激。為明確TLR2介導的下游通路，本研究通過Western Blot技術檢測了MyD88、TRAF6、IL-1β蛋白的含量變化。結果表明，CoCl24 h組和CoCl26 h組的MyD88蛋白表達水平明顯高于常氧組，P<0.05。TRAF6蛋白含量與此相一致，與常氧組相比，CoCl24 h組和CoCl26 h組的蛋白含量明顯升高，P<0.05。接下來對IL-1β蛋白進行檢測，結果顯示CoCl24 h組和CoCl26 h組的蛋白含量明顯高于常氧組，P<0.05(圖2)。

2.4 BV2細胞極化 結果表明，CoCl24 h組的蛋白含量較常氧組升高，P<0.05。CoCl26 h組的Arg1蛋白含量比CoCl24 h組升高更為明顯，P<0.05。這提示在低氧條件下，TLR2-MyD88信號通路活化，調節BV2細胞的免疫反應，使得Arg1蛋白含量隨低氧時間延長而不斷升高，誘導BV2細胞不斷向M2型轉化，對低氧暴露下的神經損傷具有良好保護作用。為進一步明確BV2細胞的狀態，本研究對M1型標記物—iNOS的蛋白含量進行了檢測。結果顯示，與常氧組相比，CoCl24 h組的iNOS蛋白含量變化差異沒有統計學意義。但是，CoCl26 h組的iNOS蛋白含量較常氧組明顯升高，P<0.05。而CoCl26 h組的iNOS蛋白含量較CoCl24 h組也明顯升高，P<0.05(圖3)。這提示，在短時間低氧條件下，iNOS蛋白含量不會發生明顯變化，BV2細胞不會向M1型轉化。但是隨著低氧時間的延長，細胞損傷不斷加重，iNOS蛋白含量明顯上升，誘導BV2細胞向M1型轉化，從而產生神經損傷作用。

A. Western Blot檢測BV2細胞內Arg1、iNOS蛋白含量；B～C. 分別表示Arg1/β-actin，iNOS/β-actin的比值，通過ImageJ測量其灰度值。與對照常氧組相比，#P<0.05。

低氧誘導的炎癥損傷過程是動態的，具有時間的特異性。在此過程中，BV2細胞可能轉變為特定表型，也可以處于過渡表型，導致M1和M2相關因子的特異性表達或混合表達。而Arg1與iNOS之間具有競爭性抑制的關系，本研究進一步分析了Arg1/iNOS比值。結果表明，與常氧組相比，CoCl24 h組的Arg1/iNOS比值變化不明顯，其差異沒有統計學意義。但CoCl26 h組的Arg1/iNOS比值較常氧組明顯降低，P<0.05(圖4)。這提示，在短時間的低氧條件下，Arg1/iNOS比值變化不明顯，且前期實驗證實Arg1蛋白含量升高，iNOS蛋白含量變化不顯著，說明BV2細胞少部分被激活，開始向M1型、M2型或過度表型轉化，更多地傾向于轉化為有益的M2型。但隨著低氧時間延長，Arg1/iNOS比值明顯降低，前期實驗證實Arg1蛋白含量升高，iNOS蛋白含量顯著升高，表明更多的BV2細胞被激活進行亞型轉化，且更傾向于表達iNOS蛋白轉化為M1表型，從而加重神經損傷。

與對照常氧組相比，#P<0.05。

3 討論

缺氧會激活缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)。HIF是一個由α亞基和β亞基組成的異源蛋白二聚體[4]。在缺氧條件下，HIF-α羥基化受到抑制，HIF-α亞基轉移到細胞核，與HIF-β亞基形成二聚體。異源二聚體復合物與其靶基因的特定DNA結合區域相結合，從而激活下游轉錄調控[5]。這會導致幾種缺氧適應性通路的激活以恢復組織穩態，例如Toll樣受體(TLR)介導的通路[6]。TLR在激活先天免疫反應以建立感染期間的穩態方面具有重要作用。目前已知人類中存在11種不同類型的TLR，而中樞神經系統(CNS)幾乎都有所表達。除了TLR3，每個TLR都需要MyD88用于下游信號傳輸[7]。研究表明，TLR2在CNS中廣泛表達，并有助于神經損傷誘導的神經膠質細胞活化。在阿爾茨海默病小鼠的額葉皮層和海馬體內TLR2和MyD88水平增加[8]，并且纖維Aβ肽需要TLR2才能發生小膠質細胞炎癥[9]。

身體的先天免疫反應會招募許多不同的細胞來啟動對新刺激的反應。這些細胞包括循環淋巴細胞(T細胞、B細胞、NK細胞)，由單核細胞發育而來的樹突狀細胞、巨噬細胞等。其中，巨噬細胞在先天免疫反應中發揮主力作用。組織特異性巨噬細胞幾乎可以在身體的所有組織中找到，并且代表不同的類別[10]。作為CNS常駐巨噬細胞，小膠質細胞充當大腦的守護者，對腦組織發育、結構改進、神經環境維護，以及對損傷的反應和隨后的重塑與修復起著至關重要的作用。在正常情況下，小膠質細胞呈現神經特異性表型[11]并保持相對靜止的狀態，持續監測腦實質情況[12]。腦組織受到刺激或損傷時，小膠質細胞可以被激活，動態地和暫時地改變它們的表型[13]。激活的小膠質細胞可以發展成經典激活(M1，促炎)或替代激活(M2，抗炎)表型，這一過程被稱為極化[14]。M1型小膠質細胞分泌促炎細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-12、IL-23和一氧化氮(NO)等，加劇炎癥和組織損傷。相比之下，M2型小膠質細胞分泌抗炎細胞因子，如TGF-β、IL-4、IL-10、IL-13，生長因子如VEGF、BDNF、PDGF以及顆粒蛋白前體等，進而抑制炎癥，促進組織恢復[15-16]。小膠質細胞表型隨著大腦微環境的變化而變化，促炎M1型和抗炎M2型小膠質細胞的比例在決定神經炎癥的進程和嚴重程度方面起著關鍵作用[17]。小膠質細胞的過度或不適當激活會加重炎癥并導致神經病理學進展[18]。基于這些功能，小膠質細胞可能通過調節自身M1/M2極化，在低氧誘導的CNS損傷與修復中發揮重要作用。

小膠質細胞是大腦的免疫細胞，當大腦受到外來刺激或者損傷時，小膠質細胞被即刻激活并根據微環境的不同呈現出不同的表型。根據小膠質細胞主要功能的不同將其表型分為M1型和M2型，其中M1型會釋放破壞性的促炎介質，阻礙中樞神經系統(CNS)的修復并擴大組織損傷；M2型則通過吞噬細胞碎片，釋放眾多保護性營養因子來促進大腦恢復[19]。因此小膠質細胞的表型轉化對CNS的損傷與修復至關重要。

而小膠質細胞的激活及表型轉化受到多方面因素的調節，但其具體機制尚不明確。有研究報道，TLR介導的信號轉導在其中發揮了重要作用。其中，TLR2轉導有助于調節炎癥反應以激活小膠質細胞M1/M2轉換，從而影響感染后小膠質細胞的存活[20]。 α-促黑素細胞激素的類似物NDP-MSH通過抑制TLR2和TLR4，促進小膠質細胞M2樣極化，從而改善神經炎性疾病[21]。

基于此，本研究考慮在低氧條件下小膠質細胞被激活并轉化為不同表型，而TLR2信號轉導在其中發揮了重要作用。通過構建CoCl2低氧模型，證實了小膠質細胞對低氧高度敏感，細胞內活性氧水平明顯升高，激活TLR2/Myd88信號通路，在低氧初期小膠質細胞被部分激活并更多的轉化為M2表型，進而釋放大量保護性營養因子對神經損傷起到保護作用。但隨著低氧時間延長，小膠質細胞失代償，更多小膠質細胞被激活并多轉化為M1表型，從而釋放大量促炎因子，造成神經損傷。

但與低氧刺激下小膠質細胞M2到M1的轉化不同，在外周系統中，巨噬細胞通常從最初的促炎M1表型轉變為抗炎M2表型[22-23]。造成這種差異的確切原因目前尚不清楚，但小膠質細胞和巨噬細胞之間的內在差異可能在其中發揮了重要作用[24]。

綜上所述，在低氧刺激下中樞神經系統中小膠質細胞M2到M1的轉化對神經的損傷與修復有著重要意義，它為早期低氧損傷提供了良好保護作用。如果低氧時間較為短暫，神經損傷在小膠質細胞M2型以及其它機制的保護作用下能夠充分代償，從而避免不可逆的神經損傷。因此在低氧過程中通過干預小膠質細胞表型轉化，延長小膠質細胞M2型表達時間以及數量，可能會為早期的神經保護提供更多的時間，對提高低氧條件下神經系統的代償能力起著重要作用。