786例慢性乙型肝炎患者恩替卡韋基因型耐藥突變及特征分析

岳秀娟 李慶 王珊珊 陳德喜 石英

近年來，隨著核苷(酸)類似物(NA)在臨床的廣泛應用，一些乙型肝炎患者在得到很好的治療同時面臨著耐藥的風險。臨床上常用的NA有拉米夫定、替比夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋和替諾福韋等。恩替卡韋和替諾福韋因為耐藥屏障高、抗病毒效果強被《慢性乙型肝炎防治指南》[1]推薦為一線用藥。本研究主要分析恩替卡韋基因型耐藥情況，為臨床了解恩替卡韋耐藥特點、流行信息及臨床合理用藥提供參考。

資料與方法

一、標本收集

2009年1月至2020年10月北京佑安醫院就診的恩替卡韋基因型耐藥株感染者786例作為研究對象。恩替卡韋基因型耐藥株感染者是指HBV POL區 耐藥位點rtL180M+rtM204V雙陽性(或者僅rtM204I陽性)并且 rtV173、rtT184、rtS202、rtV169和rtV250等5個位點中任一個或一個以上陽性者。為了敘述方便，將rtL180M+rtM204V雙陽性和rtM204I陽性者簡稱為拉米夫定基因型耐藥并用LAMr表示，下文中所述rtV173、rtT184、rtS202、rtI 169、rtM 250單位點或多位點突變，均是指在LAMr基礎上同時合并上述5種位點之一或一個以上陽性。上述任一耐藥突變類型如果合并A181和(或)N236兩個位點突變陽性者則被排除。

二、 儀器與試劑

ABI 3500XL DX 遺傳分析儀(賽默飛世爾科技有限公司)；核酸提取試劑盒(A36420，中山大學達安基因股份有限公司)，乙型肝炎病毒基因突變檢測試劑盒(PCR-測序法)(A15077，廣州立菲達安診斷產品技術有限公司)。

三、 HBV DNA 的提取

收集患者空腹靜脈血5 mL，離心后取血清。1.5 mL離心管中先后加入蛋白酶K、血清及裂解液，振蕩混勻，高速離心10 s， 72℃ 10 min，加入250 μL乙醇，渦旋振蕩15 s；將混合液吸至離心柱，高速離心1 min，再分別將500 μL的抑制物去除液和去離子液(2次)加入離心柱，高速離心，14 000×g離心3 min去除殘余乙醇；將離心柱放到新的1.5 mL離心管，72℃放置2 min，在離心柱的膜上方加入預熱的洗脫液，室溫靜置后高速離心1 min，所得即為核酸溶液。

四、統計學方法

采用Graphpad Prism 5統計學軟件對數據進行處理。計數資料以例數(%)表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、恩替卡韋基因耐藥株感染者基本情況

恩替卡韋基因耐藥患者786例，男617例，女169例，年齡為(45.7±11.5)歲。其中HBV基因型B亞型79例(10.05%)、C亞型705例(89.69%)、D亞型2例(0.25%)。

二、恩替卡韋基因耐藥突變類型

786例恩替卡韋基因耐藥株感染者的HBV基因耐藥突變類型共計21種，耐藥突變類型見表1。

表1 21種恩替卡韋基因耐藥突變類型

三、各突變位點單點突變和多點突變情況

按突變位點計算，rtT184位點突變率最高，其次是rtV173位點突變，rtI169位點突變率最低，rtV173位點、rtS202位點及rtT184位點以單位點突變為主要突變形式，rtM250位點單位點突變與聯合突變例數相差無幾，而rtI169位點以與其他4個位點聯合突變為主要突變形式。見表2。

表2 五個突變位點單點和多點突變情況[例(%)]

四、 不同耐藥位點在不同性別樣本中的變異情況

為了探究耐藥位點的突變與性別之間是否有關系，采用Fisher確切概率法對不同位點突變進行了性別間的比較，結果顯示，女性患者在rtV173位點更容易發生突變，而男性患者則在rtS202位點更容易發生突變，且差異有統計學意義(P<0.05)。

五、 不同耐藥位點在不同年齡組中的變異情況

各位點在不同年齡組的占比各有特點，rtT184位點在≥60歲年齡組占比最高，rtV173在≤30歲年齡組占比最高，rtS202則在30～60歲年齡組占比最高。將各位點在不同年齡組進行統計學分析，結果顯示，rtT184位點和rtV173位點在不同年齡組之間的差異有統計學意義(P<0.05)，其他3位點在不同年齡組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。

六、 不同耐藥位點在不同HBV基因型中的變異情況

結果顯示rtV173、rtS202、rtM250在HBV不同基因亞型中的變異差異有統計學意義，rtV173更容易在C亞型中發生突變，rtS202和rtM250更容易在B亞型中發生突變，見表3。

表3 各位點在B、C亞型間的變異情況[例(%)]

討 論

NA類藥物雖然可以有效抑制病毒復制和改善肝功能，但不能使病毒徹底清除，也很難實現HBsAg血清學轉換，這就需要長期甚至終身服用，而長期服藥就帶來了耐藥風險[2-4]。研究表明，HBV耐藥首先由基因型耐藥引起，進而造成病毒學突破和生化突破，最終導致臨床治療失敗。因此,重視基因型耐藥突變的監測和分析,可以幫助臨床及早發現耐藥，及時調整治療方案[5-6]。

恩替卡韋5年的累積耐藥發生率為1.2%；在對拉米夫定耐藥的CHB患者中，恩替卡韋治療5年的累積耐藥發生率升至51%。由于恩替卡韋在我國上市之前，已經累積了相當數量的拉米夫定經治患者，因此了解真實世界中恩替卡韋耐藥情況及特征，對于臨床治療決策具有重要參考價值[7-9]。

本研究結果顯示，786例恩替卡韋基因型耐藥患者中rtT184位點突變最常見，而rtI169位點突變少見并且以與其他位點同時突變為主，與劉妍等[4]的研究結果一致。HBV耐藥突變與基因型相關，本研究發現rtV173、rtS202、rtM250等3個位點突變與HBV基因型相關，rtV173更容易在C亞型中發生突變，rtS202和rtM250更容易在B亞型中發生突變；而rtT184、rtI169兩個位點突變在HBV不同基因型之間的差異無統計學意義。此外，本研究結果顯示女性患者在rtV173位點更容易發生突變，而男性患者則在rtS202位點更容易發生突變，而其他位點在男女之間的差異無統計學意義。在不同年齡組的比較中發現rtT184位點在≥60歲年齡患者中更容易突變，而rtV173位點突變則在≤30歲年齡患者中更容易發生，這與以往報道不同[10-14]。

本研究對真實世界中HBV恩替卡韋耐藥類型、不同耐藥位點在人群中的分布特點及不同耐藥位點在HBV不同基因型中的突變情況做了分析和闡述，對于臨床深入了解HBV恩替卡韋耐藥特點及合理調整用藥具有意義。