circ-0005273靶向miR-1200對食管癌Eca109細胞增殖和凋亡的影響

滕 寅,冉 鵬,席 陽,付寧華

(1.貴州醫科大學,貴州 貴陽,550001;2.貴州醫科大學附屬醫院 胸外科,貴州 貴陽,550004)

食管癌是常見的惡性腫瘤，其發病機制尚未闡明，且缺乏有效的治療方法[1]。研究[2-4]表明，原癌基因的異常激活及抑癌基因的失活在腫瘤的發生發展中起關鍵作用，分析腫瘤中異常表達的基因分子及其對腫瘤發生發展的影響可為腫瘤的治療提供分子靶點。環狀RNA(circRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類小分子非編碼RNA,其中circRNA可發揮miRNA分子海綿作用，進而調控miRNA靶基因的表達，二者在腫瘤的進展中發揮重要的調控作用。研究發現,circ-0005273在乳腺癌[5]、胰腺癌[6]、結腸癌[7]和甲狀腺乳頭狀癌[8]中的表達均顯著上調，可促進腫瘤的進展，或可作為腫瘤治療的分子靶點。

Circular RNA Interactome靶基因在線軟件預測顯示,circ-0005273可能發揮miR-1200分子海綿作用。研究[9]發現,miR-1200在神經膠質瘤中表達下調，通過靶向上調其表達可阻礙神經膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其在神經膠質瘤中發揮抑癌基因作用。本研究以食管癌Eca109細胞為研究對象，探討circ-0005273、miR-1200對Eca109細胞增殖和凋亡的影響，分析circ-0005273能否靶向調控miR-1200而發揮作用，以明確circ-0005273和miR-1200對食管癌發生發展的影響，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月—2019年10月在本院確診并行手術治療的41例食管癌患者的食管癌組織及癌旁組織，其中女8例，男33例，平均年齡(49.25±8.53)歲;TNM分期Ⅰ期3例,Ⅱ期16例,Ⅲ期22例;低分化19例，中分化18例，高分化4例。納入標準:首次確診者;術后病理確診為食管鱗狀細胞癌者。排除標準:合并其他惡性腫瘤者;合并糖尿病、高血壓等慢性疾病者。本研究經本院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.2 細胞和試劑

Eca109細胞系購自中國科學院上海細胞庫;RPMI 1640培養基、細胞計數試劑盒-8(CCK-8)、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京索萊寶;胎牛血清(FBS)購自杭州四季青;PCR引物、circ-0005273小干擾RNA(si-circ-0005273)及亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-1200模擬物(mimcs)及模擬對照序列(miR-NC)、miR-1200抑制劑(anti-miR-1200)及抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、circ-0005273野生型質粒(WT-circ-0005273)和突變型質粒(MUT-circ-0005273)購自上海生工;RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自大連寶生物;LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司;兔抗人活化的半胱天冬酶9(cleaved-caspase9)、活化的半胱天冬酶3(cleaved-caspase3)抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測組織中circ-0005273和miR-1200表達:將收集的癌組織和癌旁組織在液氮保護下進行研磨，采用RNA抽提試劑盒提取組織中總RNA。經逆轉錄后，行PCR擴增。擴增程序為95 ℃下10 min,95 ℃下10 s,58 ℃下30 s,72 ℃下30 s,共35個循環。引物序列:circ-0005273上游5′-AATGCCTGTGAACCCATAGTG-3′,下游5′-CTGACAGCATGAGCATCCCT-3′;GAPDH上游5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG -3′,下游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′;miR-1200上游5′-ACACTCCAGCTGGGCTCCTG AGCCATTCTG-3′,下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAGGC TCA-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。2-△△Ct法計算circ-0005273相對于GAPDH、miR-1200相對于U6的表達水平。

1.3.2 細胞培養和轉染:在超凈工作臺中復蘇Eca109細胞，加含10 % FBS的RPMI 1640培養基，并轉移至25 cm2培養瓶中，于培養箱中培養。將對數期Eca109細胞接種于6孔板中(5.0×105個/孔)，采用LipofectamineTM2000脂質體轉染法，分別轉染si-circ-0005273(si-circ-0005273組)、si-NC(si-NC組)、miR-1200 mimcs(miR-1200組)、miR-NC(miR-NC組)、共轉染si-circ-0005273與anti-miR-1200(si-circ-0005273+anti-miR-1200組)、si-circ-0005273與anti-miR-NC(si-circ-0005273+anti-miR-NC組)。轉染后12 h,更換含10 % FBS的RPMI 1640培養基，再培養24 h,收集細胞備用。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖:將各組Eca109細胞接種于96孔板中(2.5×104個/孔)，培養24 h,加10 μL CCK-8試劑，孵育2 h,采用酶標儀(λ=450 nm)檢測各孔光密度(OD)值。

1.3.4 克隆形成實驗:將各組Eca109細胞接種于6孔板中(1.0×104個/孔)，每2 d更換1次培養基，培養14 d后，棄培養基。采用4 %多聚甲醛固定30 min、0.4 %結晶紫染色20 min后，顯微鏡觀察，對超過50個細胞的克隆進行計數。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡:將各組Eca109細胞接種于6孔板中(5.0×105個/孔)，培養24 h后收集細胞。采用PBS清洗2次,1 500轉/min離心5 min,棄上清。采用Annexin V-FITC/PI試劑盒，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.6 Western Blot法檢測cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白表達:將各組Eca109細胞接種于6孔板中(5.0×105個/孔)，培養24 h后，采用RIPA試劑提取細胞中總蛋白。經BCA法定量、SDS-PAGE電泳、轉膜及5%脫脂奶粉封閉后，分別采用cleaved-caspase9(1∶500)、cleaved-caspase3(1∶500)和β-actin(1∶500)一抗在4 ℃冰箱中進行孵育，過夜后再用山羊抗兔二抗(1∶2 000)在37 ℃搖床中孵育1 h。最后加顯影液避光顯影，曝光拍照,Image J軟件分析cleaved-caspase9、cleaved-caspase3相對于GAPDH的表達量。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因實驗:將Eca109細胞接種于6孔板中(5.0×105個/孔)，采用LipofectamineTM2000脂質體轉染法，分別共轉染WT-circ-0005273與miR-1200 mimcs、WT-circ-0005273與miR-NC、MUT-circ-0005273與miR-1200 mimcs、MUT-circ-0005273與miR-NC。轉染后12 h,換新鮮培養基，再培養24 h,收集細胞并裂解,1 500轉/min離心5 min,取上清，檢測熒光素酶活性(以螢火蟲熒光強度與海腎熒光強度的比值表示)。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 癌旁組織、食管癌組織中circ-0005273和miR-1200的表達

癌旁組織、食管癌組織中circ-0005273的表達量分別為(1.00±0.06)、(4.21±0.32),miR-1200的表達量分別為(1.00±0.09)、(0.43±0.03)。癌旁組織與食管癌組織中circ-0005273和miR-1200的表達比較，差異均有統計學意義(tcirc-0005273=63.131,P<0.05;tmiR-1200=38.472,P<0.05)。

2.2 干擾circ-0005273表達對食管癌Eca109細胞增殖的影響

結果顯示,si-circ-0005273組Eca109細胞中circ-0005273表達量低于si-NC組，差異有統計學意義(P<0.05),表明干擾circ-0005273表達的Eca109細胞構建成功;干擾circ-0005273表達后,Eca109細胞OD值和克隆形成數也降低，差異有統計學意義(P<0.05),表明干擾circ-0005273表達抑制食管癌Eca109細胞增殖。見表1。

表1 干擾circ-0005273表達對食管癌Eca109細胞增殖的影響

2.3 干擾circ-0005273表達對食管癌Eca109細胞凋亡的影響

干擾circ-0005273表達后,Eca109細胞凋亡率升高，細胞中凋亡相關蛋白cleavde-caspase9和cleavde-caspase3的表達量增加，差異均有統計學意義(P<0.05),說明干擾circ-0005273表達可促進食管癌Eca109細胞凋亡。見圖1、表2。

表2 干擾circ-0005273表達對食管癌Eca109細胞凋亡的影響

2.4 circ-0005273靶向調控miR-1200的表達

Circular RNA Interactome靶基因在線軟件預測顯示,circ-0005273與miR-1200的核苷酸序列存在連續結合位點。共轉染miR-1200與WT-circ-0005273的食管癌Eca109細胞熒光素酶活性為(0.53±0.04),低于共轉染miR-NC與WT-circ-0005273的細胞熒光素酶活性(1.05±0.08),差異有統計學意義(t=17.441,P<0.05);共轉染miR-1200與MUT-circ-0005273的食管癌Eca109細胞熒光素酶活性為(1.01±0.06),與共轉染miR-NC與MUT-circ-0005273的細胞熒光素酶活性(1.02±0.07)比較，差異無統計學意義(t=0.325,P>0.05),說明circ-0005273可靶向結合miR-1200。同時,si-circ-0005273組食管癌Eca109細胞中miR-1200的表達量為(3.06±0.24),高于si-NC組的(0.97±0.06),差異有統計學意義(t=25.345,P<0.05),說明circ-0005273負調控miR-1200。見圖2。

2.5 過表達miR-1200對食管癌Eca109細胞增殖和凋亡的影響

結果顯示,miR-1200組Eca109細胞中miR-1200表達量高于miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05),表明過表達miR-1200的Eca109細胞構建成功;過表達miR-1200后,Eca109細胞OD值和克隆形成數降低，凋亡率及凋亡相關蛋白cleavde-caspase9和cleavde-caspase3的表達量增加，差異均有統計學意義(P<0.05),說明過表達miR-1200阻礙食管癌Eca109細胞增殖，并促進其凋亡。見圖3、表3。

表3 過表達miR-1200對食管癌Eca109細胞增殖和凋亡的影響

2.6 干擾miR-1200逆轉了干擾circ-0005273表達對食管癌Eca109細胞增殖和凋亡的作用

與si-circ-0005273+anti-miR-NC組比較,si-circ-0005273+anti-miR-1200組Eca109細胞中miR-1200表達量降低，細胞OD值和克隆形成數升高，凋亡率及凋亡相關蛋白cleavde-caspase9和cleavde-caspase3的表達量減少，差異均有統計學意義(P<0.05),說明干擾miR-1200可逆轉干擾circ-0005273表達對食管癌Eca109細胞增殖的抑制作用及凋亡促進作用。見圖4、表4。

表4 干擾miR-1200逆轉干擾circ-0005273對食管癌Eca109細胞增殖和凋亡的作用

3 討 論

食管癌的發病機制較為復雜，受遺傳、基因和環境等多種因素的影響[10]。分析食管癌中異常表達的基因分子及其對食管癌發生發展的影響和作用機制，可為治療提供分子靶點。研究表明，多種circRNA在食管癌中異常表達，如circ-LRP6[11]、circLPAR3[12]和circRNA_001275[13]等circRNA在食管癌中表達上調，促進食管癌的進展;而circ_RNA0023397[14]、circLARP4[15]和circ-Foxo3[16]等circRNA在食管癌中表達降低，對食管癌的進展起抑制作用。本研究結果顯示，食管癌組織中circ-0005273的表達量高于癌旁組織，干擾circ-0005273引起食管癌細胞增殖受阻，而凋亡加劇，提示circ-0005273作為致癌基因促進食管癌的進展，其可能成為食管癌治療的分子靶點。

細胞凋亡受多種基因分子和信號通路的影響，其中在線粒體信號通路介導的細胞凋亡過程中，由于線粒體膜電位的降低，導致大量細胞色素C進入細胞質，與Apaf-1結合，進而激活caspase級聯反應，誘導細胞凋亡[17]。研究[18]顯示,caspase9是caspase級聯反應的起始分子，其在受到凋亡信號刺激后，被激活生成cleavde-caspase9,進而激活下游效應的caspase3;caspase3被激活后，生成cleavde-caspase3,進而剪切細胞內各種底物，誘導細胞凋亡。本研究顯示，干擾circ-0005273表達增加了食管癌細胞中cleavde-caspase9和cleavde-caspase3蛋白的表達量，提示circ-0005273可能通過調控caspase級聯反應來影響食管癌細胞凋亡。

研究[19]顯示circRNA可與miRNA競爭性結合，調控miRNA靶基因的表達，進而發揮生物學調控作用。為了進一步探究circ-0005273參與調控食管癌細胞增殖和凋亡的分子機制，本研究證實了circ-0005273靶向結合并負向調控miR-1200,這與本研究中食管癌組織中circ-0005273表達升高而miR-1200表達降低的結果一致。研究[20]顯示,circ_0001785在骨肉瘤細胞系中高表達，敲減circ_0001785可減弱骨肉瘤細胞的增殖能力，并誘導骨肉瘤細胞凋亡，其作用機制與競爭性結合miR-1200并正向調控HOXB2的表達有關，為闡明骨肉瘤發病機制提供了新的思路;circ_0026359在胃癌中表達升高，其通過靶向抑制miR-1200并促進POLD4的表達增強胃癌細胞的順鉑抗性,circ_0026359/miR-1200/POLD4軸可能為逆轉胃癌細胞順鉑抗性提供了分子靶點[21]。本研究顯示，過表達miR-1200對食管癌細胞增殖起抑制作用，而對其凋亡發揮促進作用，且干擾miR-1200逆轉了干擾circ-0005273對食管癌細胞增殖和凋亡的影響，進而提示circ-0005273通過靶向負調控miR-1200來影響食管癌細胞的增殖和凋亡，進而促進食管癌的發展進程。

本研究也存在不足之處:miR-1200靶基因及下游信號通路對食管癌發生發展的影響還未進行研究，且未在體內驗證circ-0005273/miR-1200軸對食管癌發生發展的影響，這將是后續研究的重點。

綜上所述，食管癌組織中circ-0005273表達升高，而miR-1200表達降低;干擾circ-0005273可有效阻礙食管癌細胞的增殖能力，并誘導食管癌細胞凋亡，其作用機制可能與靶向負調控miR-1200有關,circ-0005273/miR-1200軸可能為食管癌發病機制的闡明及治療靶點的選擇提供了新途徑。