基于網絡藥理學的準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌作用機制研究

楊 梅,迪麗美合日·迪力夏提,趙翡翠,2,3

(1.新疆醫科大學第四臨床醫學院,新疆 烏魯木齊,830000;2.新疆醫科大學附屬中醫醫院 藥學部,新疆 烏魯木齊 830000;3.新疆中藥炮制研究重點實驗室,新疆 烏魯木齊,830000)

卵巢癌起病隱匿，約70%的患者發現時已屬晚期，病死率居婦科惡性腫瘤的首位[1-2]。目前卵巢癌的治療方法為手術、放療和化療，但化療具有較強的毒副作用及耐藥性，且復發率高[3-5]。中醫研究[6]認為腫瘤是因正氣虧虛，氣滯、血瘀、痰結、濕聚、熱毒等互相搏結，日久積滯形成腫塊而導致，可采用烏頭屬的辛溫之藥以毒攻毒、開結破凝，以溫陽散寒之法治療腫瘤。現代藥理研究[7]也證實烏頭類中藥對腫瘤治療效果顯著。準噶爾烏頭是毛茛科植物準噶爾烏頭的干燥塊根，專產于中國新疆維吾爾自治區北部地區，作為哈薩克族重要的傳統民族藥材，準噶爾烏頭在哈薩克族民間常被作為“藥用烏頭”，《哈薩克藥志》等文獻[8-10]記載其性味辛、苦、大熱，有毒，炮制減毒后用于治療風濕性關節炎、腹部腫塊、肋間神經痛等。研究[11]表明準噶爾烏頭炮制品具有一定的抗腫瘤活性，但作用機制尚不明確。網絡藥理學[12]關注整體性和系統性的特點與中醫藥學的整體觀念相吻合，有助于探索中藥多成分、多靶點、多途徑的作用機制。本研究采用網絡藥理學方法預測準噶爾烏頭炮制品的抗卵巢癌潛在作用機制，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

準噶爾烏頭及其炮制品、烏頭屬植物。目前國內外未見準噶爾烏頭及其炮制品抗卵巢癌作用機制的文獻且有關準噶爾烏頭的文獻很少，故本研究利用準噶爾烏頭與烏頭屬植物具有化學親緣性的特點擴大檢索范圍[13-15],收集準噶爾烏頭及烏頭屬植物全部化學成分，并從中篩選活性成分納入準噶爾烏頭炮制品活性成分中研究。

1.2 數據庫、分析平臺及軟件

本研究使用的數據庫、分析平臺及軟件見表1。

表1 數據庫、分析平臺及軟件

1.3 藥物活性成分收集與篩選

通過TCMSP、BATMAN-TCM、TCM-ID及文獻收集準噶爾烏頭及其炮制品、烏頭屬植物所有化學成分。根據口服生物利用度(OB)與類藥性(DL)對成分進行篩選。考慮到樣本量及數據的復雜性，篩選標準定為:OB≥20%，DL≥0.14[16]。

1.4 藥物作用靶點預測及有效活性成分-靶點網絡圖構建

通過PubChem數據庫確認篩選出的活性成分，下載其2D結構導入Swiss Target Prediction數據庫進行靶點預測。借助TCMSP、BATMAN-TCM、TCM-ID數據庫對確認的活性成分進行靶點預測。將獲得的全部藥物靶點去重，導入Uniprot數據庫校正靶點信息，得到準噶爾烏頭炮制品有效活性成分作用靶點。經Cytoscape 3.6.1可視化處理，構建有效活性成分-靶點網絡圖。

1.5 人卵巢癌靶點篩選

在TTD數據庫中以“Ovarian cancer”為關鍵詞，檢索得到人卵巢癌相關靶點;在DisGeNET數據庫中以“Ovarian cancer”為關鍵字進行檢索，選取其中基因-疾病關聯評分(score_gda)>0.05的靶點信息進行研究[17];在GeneCards數據庫中以“Ovarian cancer”為關鍵字進行檢索，選取其中相關度得分(relevance score)≥20的靶點信息進行研究[18]。

在GEO數據庫中以“Ovarian cancer”為關鍵詞檢索相關芯片，獲取編號為GSE18520的芯片文件和GPL570的芯片基因注釋文件。該芯片數據包含53例卵巢癌標本和10例正常卵巢表面上皮(OSE)刷。對芯片數據進行基因差異表達在線分析，篩選出顯著差異基因，篩選標準為:P<0.05,差異倍數(FC)>4[19]。應用R語言ggplot2程序包繪制火山圖。最終獲得人卵巢癌的差異表達基因。

將TTD、DisGeNET、GeneCard數據庫中獲取的人卵巢癌相關靶點與GEO數據庫中獲得的人卵巢癌差異表達基因取并集，將并集中的靶點信息導入Uniprot數據庫進行校對，最終獲得人卵巢癌相關靶點。

1.6 準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌關鍵靶點挖掘

將1.4標題內容中預測到的藥物作用靶點與1.5標題內容中檢索到的人卵巢癌潛在靶點經Draw Venn Diagram在線軟件取交集，獲得準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌關鍵靶點，并繪制維恩圖。

1.7 “疾病-藥物-成分-靶點”網絡構建

將1.6標題內容中得到的準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌關鍵靶點與活性成分對應的靶點進行比對，篩選出能夠作用到關鍵靶點上的活性成分，剔除未作用到關鍵靶點上的活性成分，整合對應有效活性成分，導入Cytoscape 3.6.1軟件，構建“疾病-藥物-成分-靶點”網絡。

1.8 DAVID富集分析

采用DAVID數據庫對關鍵靶點進行基因本體(GO)生物學功能分析及京都基因和基因組數據庫(KEGG)富集分析。運用R語言ggPlot2程序包對GO富集分析結果中滿足P<0.05且按P值升序排列的前20條結果繪制條形圖，對KEGG富集分析結果中滿足P<0.05且按P值升序排列的前20條結果繪制氣泡圖。

1.9 關鍵靶點蛋白互作網絡構建

將1.6標題內容中挖掘出的關鍵靶點映射到String數據庫，選擇物種為人，以最低要求互動得分0.7為篩選參數[20]，對結果進行整合，借助Cytoscape 3.6.1進行可視化處理，構建準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌的關鍵靶點蛋白質互作(PPI)網絡圖并進行網絡分析。

2 結 果

2.1 準噶爾烏頭炮制品活性成分

從TCMSP、BATMAN-TCM、TCM-ID及文獻中獲得準噶爾烏頭及其炮制品、烏頭屬植物化學成分577個，按照同時滿足OB≥20%、DL≥0.14的標準篩選出有效活性成分41個。

2.2 準噶爾烏頭炮制品作用靶點及有效活性成分-靶點網絡圖

通過PubChem數據庫對41個有效活性成分確認后，借助Swiss Target Prediction、TCMSP、BATMAN-TCM、TCM-ID預測有效活性成分靶點，得到有對應靶點的有效活性成分30個，見表2。經Cytoscape 3.6.1進行可視化處理，構建有效活性成分-靶點網絡圖，其中有效活性成分的作用靶點627個，有效活性成分與對應靶點間存在1 703個相互關系。見圖1。

2.3 人卵巢癌作用靶點

在TTD、DisGeNET、GeneCards數據庫中分別獲得人卵巢癌靶點42、70、788個。在GEO數據庫中獲得1 145個顯著差異基因(去重后為1 139個)，其中上調基因516個，下調基因629個，繪制人卵巢癌差異基因火山圖，見圖2。將上述4個數據庫中獲得的人卵巢癌靶點及人卵巢癌顯著差異基因取并集，經Uniprot數據庫校對，最終得到人卵巢癌靶點1 667個。

表2 準噶爾烏頭炮制品有效活性成分信息

2.4 準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌關鍵靶點

將627個準噶爾烏頭炮制品有效活性成分作用靶點與1 667個人卵巢癌靶點經Draw Venn Diagram在線軟件取交集，獲得準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌關鍵靶點152個，并以“靶點名稱(縮寫)”的形式表示:即72 kDa type IV collagenase(MMP2)、transketolase(TKT)、estradiol 17-beta-dehydrogenase 1(HSD17B1)、estradiol 17-beta-dehydrogenase 2(HSD17B2)、high affinity nerve growth factor receptor(NTRK1)、matrilysin(MMP7)、nitric oxide synthase(NOS2)、fibroblast growth factor receptor 1(FGFR1)、hepatocyte growth factor receptor(MET)、cytochrome P450 2D6(CYP2D6)、C5a anaphylatoxin chemotactic receptor 1(C5AR1)、G1/S-specific cyclin-E1(CCNE1)、amine oxidase (flavin-containing)A (MAOA)、cyclin-dependent kinase 1(CDK1)、focaladhesionkinase1(PTK2)、sexhormone-bindingglobulin(SHBG)、cholinesterase(BCHE)、apoptosisregulatorBcl-2(BCL2)、phosphatidylinositol4,5-bisphosphate3-kinasecatalyticsubunitbetaisoform(PIK3CB)、endothelin-1receptor(EDNRA)、gonadotropin-releasinghormonereceptor(GNRHR)、beta-secretase2(BACE2)、retinoicacidreceptorbeta(RARB)、aurorakinaseA(AURKA)、alpha-1Aadrenergicreceptor(ADRA1A)、arylhydrocarbonreceptor(AHR)、dihydrofolatereductase(DHFR)、aurorakinaseB(AURKB)、aromatase(CYP19A1)、latelet-derivedgrowthfactorreceptorbeta(PDGFRB)、integrinbeta-1(ITGB1)、mast/stemcellgrowthfactorreceptorKit(KIT)、tyrosine-proteinkinaseJAK2(JAK2)、prostaglandinG/Hsynthase2(PTGS2)、G1/S-specificcyclin-D1(CCND1)、neuropeptideYreceptortype1(NPY1R)、estrogenreceptor(ESR1)、cyclin-dependentkinase4(CDK4)、thymidylatesynthase(TYMS)、cGMP-inhibited3′,5′-cyclicphosphodiesteraseA(PDE3A)、dualspecificitymitogen-activatedproteinkinasekinase4(MAP2K4)、phosphatidylinositol4,5-bisphosphate3-kinasecatalyticsubunitdeltaisoform(PIK3CD)、cyclin-A2(CCNA2)、interstitialcollagenase(MMP1)、solutecarrierfamily2(SLC2A1)、indoleamine2,3-dioxygenase1(IDO1)、vascularendothelialgrowthfactorreceptor1(FLT1)、tyrosine-proteinkinasereceptorUFO(AXL)、mitogen-activatedproteinkinase1(MAPK1)、matrixmetalloproteinase-14(MMP14)、E3ubiquitin-proteinligaseMdm2(MDM2)、epidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)、receptortyrosine-proteinkinaseerbB-2(ERBB2)、mitogen-activatedproteinkinase8(MAPK8)、proteinase-activatedreceptor1(F2R)、tyrosine-proteinkinaseABL1(ABL1)、highaffinitycAMP-specific3′,5′-cyclicphosphodiesterase7A(PDE7A)、mitogen-activatedproteinkinase12(MAP3K12)、beta-glucuronidase(GUSB)、serine/threonine-proteinkinaseChk2(CHEK2)、telomerasereversetranscriptase(TERT)、proto-oncogenetyrosine-proteinkinaseSrc(SRC)、cyclin-dependentkinase2(CDK2)、progesteronereceptor(PGR)、serine/threonine-proteinphosphatase2Acatalyticsubunitalphaisoform(PPP2CA)、steroid17-alpha-hydroxylase/17,20lyase(CYP17A1)、gamma-aminobutyricacidreceptorsubunitbeta-3(GABRB3)、plasminogen(PLG)、serine/threonine-proteinkinasePAK4(PAK4)、phosphatidylinositol3-kinaseregulatorysubunitalpha(PIK3R1)、acetyl-CoAcarboxylase2(ACACB)、beta-3adrenergicreceptor(ADRB3)、isocitratedehydrogenase1(IDH1)、histonedeacetylase1(HDAC1)、P2Xpurinoceptor7(P2RX7)、estrogenreceptorbeta(ESR2)、ephrintype-Breceptor4(EPHB4)、cytochromeP4501B1(CYP1B1)、M-phaseinducerphosphatase1(CDC25A)、prostaglandinE2receptorEP3subtype(PTGER3)、deoxycytidinekinase(DCK)、arachidonate5-lipoxygenase(ALOX5)、protein-glutaminegamma-glutamyltransferase2(TGM2)、tyrosine-proteinphosphatasenon-receptortype11(PTPN11)、serine/threonine-proteinkinasePLK1(PLK1)、dipeptidylpeptidase4(DPP4)、serine/threonine-proteinkinaseChk1(CHEK1)、kinesin-likeproteinKIF11(KIF11)、potassiumvoltage-gatedchannelsubfamilyHmember2(KCNH2)、peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma(PPARG)、proteinkinaseCdeltatype(PRKCD)、proto-oncogenetyrosine-proteinkinasereceptorRet(RET)、multidrugresistanceprotein1(ABCB1)、cannabinoidreceptor1(CNR1)、glucocorticoidreceptor(NR3C1)、serine/threonine-proteinkinasemTOR(MTOR)、integrin-linkedproteinkinase(ILK)、mitogen-activatedproteinkinase14(MAPK14)、cyclin-dependentkinase6(CDK6)、tyrosine-proteinkinaseCSK(CSK)、RAFproto-oncogeneserine/threonine-proteinkinase(RAF1)、gamma-aminobutyricacidreceptorsubunitbeta-2(GABRB2)、signaltransducerandactivatoroftranscription3(STAT3)、sphingosinekinase1(SPHK1)、TGF-betareceptortype-1(TGFBR1)、type-1angiotensinⅡreceptor(AGTR1)、cathepsinD(CTSD)、Kelch-likeECH-associatedprotein1(KEAP1)、inducedmyeloidleukemiacelldifferentiationproteinMcl-1(MCL1)、G1/S-specificcyclin-D3(CCND3)、interleukin-6(IL6)、heatshockproteinHSP90-alpha(HSP90AA1)、poly(ADP-ribose)polymerase1(PARP1)、vitaminD3receptor(VDR)、max-likeproteinX(MLX)、rho-associatedproteinkinase1(ROCK1)、vascularendothelialgrowthfactorreceptor2(KDR)、UDP-N-acetylglucosamine-peptideN-acetylglucosaminyltransferase110kDasubunit(OGT)、ATP-bindingcassettesub-familyGmember2(ABCG2)、multipleendocrineneoplasia1(MEN1)、retinoicacidreceptoralpha(RARA)、tyrosine-proteinphosphatasenon-receptortype1(PTPN1)、beta-secretase1(BACE1)、phosphatidylinositol4,5-bisphosphate3-kinasecatalyticsubunitgammaisoform(PIK3CG)、NAD(P)Hdehydrogenase(quinone)1(NQO1)、phosphatidylinositol4,5-bisphosphate3-kinasecatalyticsubunitalphaisoform(PIK3CA)、Interleukin-2(IL2)、DNAtopoisomerase2-alpha(TOP2A)、insulin-likegrowthfactor1receptor(IGF1R)、calcitoningene-relatedpeptidetype1receptor(CALCRL)、intercellularadhesionmolecule1(ICAM1)、Bcl-2-likeprotein1(BCL2L1)、mitogen-activatedproteinkinase3(MAPK3)、inhibitorofnuclearfactorkappa-Bkinasesubunitepsilon(IKBKE)、hypoxia-induciblefactor1-alpha(HIF1A)、Toll-likereceptor4(TLR4)、tyrosine-proteinkinaseJAK1(JAK1)、fattyacid-bindingprotein(FABP4)、G1/S-specificcyclin-D2(CCND2)、RAC-alphaserine/threonine-proteinkinase(AKT1)、dualspecificitymitogen-activatedproteinkinase1(MAP2K1)、highaffinitycAMP-specificandIBMX-insensitive3′,5′-cyclicphosphodiesterase8B(PDE8B)、prostaglandinG/Hsynthase1(PTGS1)、macrophagecolony-stimulatingfactor1receptor(CSF1R)、transcriptionfactorAP-1(JUN)、dualspecificityproteinkinaseTTK(TTK)、androgenreceptor(AR)、proteinkinaseCalphatype(PRKCA)、trypsin-1(PRSS1)、ribosomalproteinS6kinasebeta-1(RPS6KB1)、matrixmetalloproteinase-9(MMP9)、DNAtopoisomerase1(TOP1)。繪制的維恩圖見圖3。

2.5 “疾病-藥物-成分-靶點”網絡圖

應用Cytoscape 3.6.1軟件構建“疾病-藥物-成分-靶點”網絡圖，該網絡中共有181個節點，其中紅色為疾病節點，共1個;藍色為藥物節點，共1個;紫色為成分節點，共27個(剔除了3個未作用到關鍵靶點上的活性成分);綠色為靶點節點，共152個;共663條邊。見圖4。

2.6 DAVID富集分析

通過DAVID數據庫富集分析獲得GO條目559條(P<0.05),其中生物過程(BP)條目404個，主要包括蛋白磷酸化、信號轉導、細胞增殖正調控等;細胞組成(CC)條目67個，主要包括細胞周期素依賴性蛋白激酶全酶復合物、磷脂酰肌醇-3-激酶復合物等;分子功能(MF)條目88個，主要包括ATP結合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白絲氨酸激酶活性等。按P值排序，將每個模塊前20位條目使用R語言ggplot2程序包繪制條形圖，橫坐標為富集基因的個數，柱的顏色代表-log10(P)值的大小，顏色由藍到紅表示-log10(P)值遞增，見圖5。

通過DAVID數據庫對關鍵靶點進行KEGG通路富集分析得到108條通路(P<0.05),其中包括癌癥途徑、PI3K/Akt信號通路、VEGF信號通路、HIF-1信號通路等。按P值排序，選取前20位通路，使用R語言ggplot2程序包繪制氣泡圖，橫坐標表示該通路所富集的基因占總體輸入基因的比率，氣泡顏色越紅提示-log10(P)值越大，表示KEGG通路富集越顯著，氣泡越大表示KEGG通路越重要，見圖6。

2.7 關鍵靶點PPI網絡

152個關鍵靶點映射到String數據庫，隱藏無相互關聯的靶點，獲得關鍵靶點相互作用網絡圖，包含148個靶點(4個靶點未參與),1 052條邊，平均自由度為13.8,平均局部聚類系數為 0.54。借助Cytoscape 3.6.1進一步進行可視化處理，構建出準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌的關鍵靶點PPI網絡圖，并使用Cytoscape 3.6.1 軟件中Network Analyzer工具對網絡中的節點進行相關參數分析，其中degree值越大、節點越大、節點的顏色越深，節點的顏色由綠色變為橙色，表示該節點越重要;combine score值越大、邊越粗，表示由該邊代表的靶點間關系越密切，見圖7。

2.8 核心靶點分析

通過Cytoscape 3.6.1計算,PPI網絡中節點的度值的中位值為24.500,介數的中位值為302.240,緊密度的中位值為0.164,度值、介數和緊密度均超過中位值的靶點共18個，分別為AKT1、MAPK1、PIK3CA、STAT3、SRC、MAPK3、HSP90AA1、PIK3R1、EGFR、MAPK8、JAK2、IL6、CCND1、JUN、MMP9、ESR1、MAPK14、AR。這些節點可能是準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌的核心靶點。

3 討 論

卵巢癌是嚴重危害女性健康的常見惡性腫瘤之一。目前，化療藥物的毒副作用和耐藥是卵巢癌治療中的重要問題。中醫[6]認為腫瘤屬“積聚”“癥瘕”等范疇，采用烏頭類大辛大溫之品，以其溫陽散寒之功治療腫瘤已得到醫學界的認可[21]。準噶爾烏頭在哈薩克族民間作為“藥用烏頭”長期使用，研究[11]表明，準噶爾烏頭具有一定的抗卵巢癌活性，但作用機制不明確。

本研究發現準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌活性成分27個，包括準噶爾烏頭堿、脫氧烏頭堿、次烏頭堿、亞油酸甲酯等。準噶爾烏頭堿、脫氧烏頭堿、次烏頭堿是準噶爾烏頭中已明確的化學成分[22-23],其余活性成分是根據準噶爾烏頭與烏頭屬植物具有化學親緣性的特點[13-15],通過以烏頭屬植物代表性化學成分擴大數據庫檢索范圍而收集到的烏頭屬植物含有的化學成分。本研究預測出準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌作用靶點可能是PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、EGFR、MAPK1、MAPK3、CDK6等。PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG是磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)的催化異構體。PI3K是原癌基因，能磷酸化磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇4-磷酸和磷脂酰肌醇4，5-二磷酸，生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3),PIP3招募PH結構域蛋白到細胞膜，包括AKT1和PDPK1,從而激活涉及細胞生長、生存、增殖、運動和形態的信號級聯，發揮關鍵作用[24]。EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一，能激活多種下游信號通路，促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移[25-26]。研究[27]表明EGFR是解決上皮性卵巢癌化療耐藥問題新的治療靶點。MAPK1、MAPK3屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶,MAPK在許多腫瘤中都表現出異常表達，在卵巢癌組織中,MAPK1、MAPK3均高表達，表明其在卵巢癌中可能被異常激活,MAPK1、MAPK3可能是卵巢癌的作用靶點[28]。CDK6作為重要的細胞周期促進因子，參與誘導腫瘤細胞的增殖,CDK6過表達在卵巢癌發病和導致不良預后方面發揮了重要的作用,CDK6可作為潛在靶點用于卵巢癌的治療[29]。

本研究預測出準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌信號通路有癌癥途徑、PI3K/Akt信號通路、VEGF信號通路、HIF-1信號通路等，其中PI3K-Akt信號通路通過多種途徑抑制腫瘤細胞凋亡。PI3K/Akt 信號通路通過活化PI3K 后產生PIP3，進而活化Akt，促進腫瘤血管形成，加劇腫瘤侵襲和轉移[30]。卵巢癌的發生、發展以及化療耐藥都與PI3K/AKT信號通路的過度激活密切相關，該通路能夠介導卵巢癌細胞的遷移和侵襲，抑制卵巢癌細胞的凋亡和自噬[31-33]。VEGF信號通路是上皮性卵巢癌多藥耐藥相關信號通路之一[34]。研究[35]表明，通過使用血管抑制劑競爭性結合血管內皮生長因子受體的激酶結構域，可以抑制VEGF通路，從而明顯提高晚期卵巢癌患者的存活率。缺氧是實體腫瘤微環境的基本特征之一，腫瘤內的缺氧環境與腫瘤的侵襲、轉移密切相關[36-37]。HIF-1是在缺氧條件下普遍存在的重要調節因子[38-39],HIF-1由α亞基(α亞基影響HIF-1的活性)和β亞基(β亞基是結構性亞基)構成[40-41]。HIF-1對基因表達的調節導致葡萄糖攝取和氧化，能量產生和血管生成的改變，進而調節多種靶基因轉錄，使得糖酵解限速酶激活，有氧糖酵解增加、葡萄糖攝取率提高等，從而促進腫瘤細胞在缺氧或低氧條件下增殖、侵襲及轉移[42-43]。研究[44-45]表明，通過抑制HIF-1α途徑，可以下調HK2、LDHA表達，從而抑制卵巢癌細胞的糖酵解，有效抑制卵巢癌細胞增殖。

綜上所述，本研究通過綜合運用網絡藥理學技術探討準噶爾烏頭炮制品抗卵巢癌可能的關鍵靶點及分子機制，為治療卵巢癌提供新的切入點，為民族藥的開發利用提供新的思路。由于本研究結論是借助網絡藥理學技術對數據庫進行挖掘得出，為保證網絡藥理學預測結果的可靠性和準確性，后續仍需進一步實驗驗證。