馬鈴薯鮮粉污染菌的分離鑒定及抑制物篩選

魏雄博，白永宏，鮑壹江，王亞潔，劉 乾，任建芳，陳國(guó)梁，1b

（1.延安大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 延安 716000；2.延安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 延安 716000）

在中國(guó)，粉條有千余年的加工歷史，其含有豐富的碳水化合物、膳食纖維、蛋白質(zhì)及鈣、鎂、鐵、鉀、磷、鈉等礦物質(zhì)，口感爽滑、老少皆宜，有和胃、健脾、益氣之功效，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，在大眾飲食中占據(jù)十分重要的地位［1，2］。但是干粉在食用時(shí)要提前浸泡，食用不便，與現(xiàn)代快節(jié)奏生活不相適應(yīng)。冷鮮淀粉食品近年來(lái)在超市中越來(lái)越多見(jiàn)，在各大城市中鮮粉條也正在被消費(fèi)者所接受，但鮮粉因其高水分，易發(fā)生變質(zhì)，而保質(zhì)期短，致使其銷售半徑小，貨架期短，對(duì)產(chǎn)品的生產(chǎn)、銷售及安全食用帶來(lái)了不利的影響［3］。因此，探究引起鮮粉變質(zhì)的菌類并找到相應(yīng)的抑制物，對(duì)于其生產(chǎn)、銷售具有重要的指導(dǎo)意義，而有關(guān)這方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)到。為了篩選出合適的抑菌物，根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道及前期研究的結(jié)果，篩選出柑橘精油、八角茴香精油、雙乙酸鈉和山梨酸鉀4種抑菌物。植物精油這一天然保鮮劑其抗氧化性、抑菌活性常用于延長(zhǎng)食品的保鮮及食品口感、風(fēng)味的改良［4，5］，研究表明柑橘精油和八角茴香精油有良好的殺菌、殺蟲(chóng)、抗氧化等生物活性［6-9］，從而能夠保護(hù)食品免受氧化變質(zhì)，而且其食品安全性已經(jīng)獲美國(guó)食品藥品管理局準(zhǔn)許應(yīng)用于食品領(lǐng)域［10］。雙乙酸鈉和山梨酸鉀是新型高效的防霉、防腐劑，且無(wú)毒副致癌、致病因素，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外食品工業(yè)［11-14］。本研究開(kāi)展馬鈴薯鮮粉中易染菌分離鑒定及抑制物篩選研究，以期為鮮粉條產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

各種污染變質(zhì)的真空包裝馬鈴薯鮮粉，由陜西省榆林市定邊縣潤(rùn)澤署業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司提供；2種已鑒定保藏的馬鈴薯鮮粉易染菌種（芽孢桿菌屬、埃希氏菌屬），由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

雙乙酸鈉、山梨酸鉀均為食品級(jí)，上海羅恩試劑有限公司；PCR試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；八角茴香及柑橘，購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離純化 在無(wú)菌環(huán)境下取一定量的各類污染變質(zhì)鮮粉條，剪碎、加無(wú)菌生理鹽水充分搖晃，作為污染菌原液，然后接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，在28℃下恒溫培養(yǎng)24～48 h。從中挑選出生長(zhǎng)形態(tài)和顏色不同的單菌落，再在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線、分離純化。重復(fù)試驗(yàn)，直至獲得單一菌落為止。

1.2.2 菌株的鑒定

1）生理鑒定。根據(jù)菌落形狀、色澤等外在形態(tài)，初步篩出單菌落，并采用革蘭氏染色法進(jìn)行染色后在顯微鏡下觀察鑒定［15］。

2）16SrDNA PCR擴(kuò)增。將篩選出的單菌落培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期作為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3’）、1492R（5’-GG?TACCTTGTTACGACTT-3’）［16］。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板2.5μL，Taq酶0.5μL，Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，引物各1μL，ddH2O 15.5μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃補(bǔ)充延伸10 min，4℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并對(duì)特異性擴(kuò)增條帶進(jìn)行回收，將擴(kuò)增產(chǎn)物交西北大學(xué)太白校區(qū)國(guó)家微生物檢測(cè)中心測(cè)序。

3）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。獲得DNA序列后，在NC?BI網(wǎng)站上（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行核酸數(shù)據(jù)比對(duì)分析，并用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)［17］，對(duì)其進(jìn)行歸類。

1.3 抑菌試驗(yàn)

1.3.1 抑菌物的篩選及制備 八角茴香精油粗提物的制備：取一定量干八角茴香于圓底燒瓶中加入去離子水（料液比1∶7），在160 W功率下微波提取30 min，得到無(wú)色揮發(fā)油，用無(wú)水Na2SO4干燥，4℃儲(chǔ)藏備用［18］。

柑橘精油粗提物的制備：將新鮮橘皮洗凈、烘干、粉碎，稱取一定量置于蒸餾瓶中，加去離子水（料液比1∶16）及適量NaCl作為萃取助劑［19］，提取2.5 h，將收集的餾出物經(jīng)由石油醚萃取后水浴除去石油醚，即柑橘精油粗提物。

將2種精油粗提物、雙乙酸鈉、山梨酸鉀，按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)配成10%、20%、30%、40%、50%濃度梯度溶液，其中精油粗提物用無(wú)水乙醇作溶劑，雙乙酸鈉和山梨酸鉀用無(wú)菌去離子水作溶劑。

1.3.2 抑菌效果的測(cè)定 采用濾紙片法測(cè)定抑菌效果，以十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小。用無(wú)水乙醇、無(wú)菌去離子水做空白對(duì)照。抑菌圈直徑（mm）=樣品抑菌圈直徑－空白對(duì)照，3次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌株的生理鑒定 對(duì)分離出的菌株經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色，初步篩選獲得4種菌株，分別為L(zhǎng)-1、L-2、L-3和L-4。由表1可知，L-1菌落顏色為粉紅色，L-2菌落顏色為淡黃色，L-3和L-4菌落顏色為乳白色。L-1、L-2、L-4三株菌為桿狀菌，L-3為球狀菌。4種菌株菌落均不透明，且都為革蘭氏陽(yáng)性菌。

表1 4種菌株形態(tài)及理化特征

2.1.2 菌落PCR鑒定 以細(xì)菌的通用引物27F和1492R作為上下游引物，對(duì)馬鈴薯鮮粉貯藏期分離出的4株病原細(xì)菌的16s rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的電泳檢測(cè)結(jié)果只得到了L-2菌株的清晰穩(wěn)定條帶，片段約為1 500 bp（圖1）。

圖1 L-2菌株16Sr DNA電泳圖譜

2.1.3 16SrRNA序列比對(duì) 將得到的測(cè)序序列用DNA-MAN軟件進(jìn)行拼接，得到所測(cè)樣本的DNA序列后，在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)序列比對(duì)。經(jīng)序列比對(duì)，該序列與多條已知的短小桿菌屬（Cur?tobacterium）序列同相似性達(dá)到了99%～100%（表2），根據(jù)16SrRNA序列相似性達(dá)到99%以上則認(rèn)為是同一個(gè)種［20］，由此可以初步判定該DNA序列所代表的細(xì)菌L-2為短小桿菌屬。根據(jù)序列的對(duì)比結(jié)果，利用MEGA 5.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析［21］。從圖2可以看出，該菌隸屬于短小桿菌屬分支，這與序列比對(duì)分析結(jié)果一致。

圖2 L-2菌株根據(jù)16Sr DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)育樹(shù)

表2 L-2菌株DNA BLAST對(duì)比結(jié)果

2.2 添加物的抑菌效果

通過(guò)濾紙片法用短小桿菌屬（C-1）、埃希氏菌屬（E-2）、芽孢桿菌屬（B-3）測(cè)試5種不同濃度的添加物抑菌效果。由表3可知，添加物溶液濃度與抑菌效果密切相關(guān)，4種抑菌物對(duì)3種菌的抑制圈直徑都隨著抑菌物濃度增加而增大，其中同等濃度下雙乙酸鈉對(duì)3種菌抑制效果最好。八角茴香精油、柑橘精油對(duì)于短小桿菌屬的抑制作用隨濃度增加提升較小，雙乙酸鈉和八角茴香精油對(duì)埃希氏菌屬抑制效果隨著濃度增加抑制效果增幅較大。4種抑菌物對(duì)病原菌抑菌效果依次為雙乙酸鈉>八角茴香油>山梨酸鉀>柑橘精油。

3 小結(jié)

從污染的馬鈴薯鮮粉中篩選得到一株病原菌，經(jīng)過(guò)16SrDNA分子鑒定并建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)鑒定該菌屬于短小桿菌屬（Curtobacterium）。而污染馬鈴薯鮮粉的病原菌可能與加工方式、包裝技術(shù)、保藏時(shí)間等有關(guān)系［22，23］，所以引起馬鈴薯鮮粉污染的菌株種類、數(shù)量有待進(jìn)一步分離鑒定。經(jīng)過(guò)抑菌圈數(shù)據(jù)對(duì)比，同等濃度下雙乙酸鈉對(duì)供試的3種易染菌的抑菌圈平均直徑均大于其他3種抑菌物，其作為天然抑菌劑有比較好的研究前景，可進(jìn)一步作為添加物進(jìn)行鮮粉保鮮貯藏試驗(yàn)。