一株多重耐藥產腸毒素大腸桿菌的分離鑒定及生物學特性的研究

王寧寧，李曉月，劉澤文，劉 威，高 婷，周丹娜，楊克禮，郭 銳，梁 婉，陳文杰，貝為成，田永祥，袁芳艷

（1.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/農業農村部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室/畜禽病原微生物學湖北省重點實驗室，武漢 430064；2.華中農業大學/生豬養殖協同中心，武漢 430070；3.廣西揚翔股份有限公司，廣西 貴港 537106）

產腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）屬于腸桿菌科埃希氏菌屬成員，為革蘭氏陰性的直桿菌，無芽孢，有菌毛，主要分為F4（K88）、F5（K99）、F6（987P）和F41四種。腸毒素分為不耐熱腸毒素（LT）和耐熱腸毒素（ST）兩種。在動物中，只有豬源菌株能同時產生LT和ST，其他菌株僅產生ST。ETEC是引起仔豬大腸桿菌性腹瀉的最常見的流行病原體，是一類引起人和幼畜（初生仔豬、犢牛、羔羊）腹瀉的重要病原菌，初生幼畜被ETEC感染后，常因劇烈水樣腹瀉和迅速脫水而死亡，發病率和死亡率均很高，給養殖行業帶來嚴重的經濟損失。在ETEC眾多血清型中，K88血清型流行最為廣泛［1，2］。

本研究從湖北省某養豬場采集腹瀉豬腸道樣品，進行細菌分離鑒定，通過菌落形態、PCR檢測等進行鑒定，分離到產腸毒素大腸桿菌，進一步通過耐藥性檢測，表明分離菌株對阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考、四環素、多西環素、磺胺異惡唑等青霉素類、四環素類、氯霉素類、磺胺類耐藥。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 病料 取自湖北省某豬場腹瀉仔豬的腸道樣品。

1.1.2 試劑 麥康凱瓊脂培養基、LB瓊脂培養基、LB肉湯培養基等，按常規方法配制。革蘭氏染色液、Vazyme 2×Taq Master Mix、DL2000 DNA Maker購自寶生物工程（大連）有限公司；細菌藥敏試紙購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 細菌分離純化培養

用無菌鑷子取腸道組織病料，劃線接種于麥康凱瓊脂培養基中37℃培養18～24 h，挑取單個粉紅色疑似菌落繼續劃線，于麥康凱瓊脂培養基中進行純化培養。

1.3 細菌鏡檢

參考文獻［3］，對疑似菌株進行革蘭氏染色，并用光學顯微鏡進行細菌形態觀察。

1.4 分子生物學鑒定

1.4.1 引物合成 所用引物參考劉澤文等［8］合成大腸桿菌PCR引物進行，由擎科生物技術有限公司合成。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.4.2 可疑菌株DNA提取 挑取可疑菌落接種于LB肉湯中，37℃振蕩培養18～24 h。處理菌液，收集上清液作DNA模板，并以大腸桿菌K88株作陽性對照，無菌水作陰性對照。

1.4.3 PCR擴增 參考Vazyme 2×TaqMaster Mix使用說明書。PCR反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s；52℃退火30 s；72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min，取適量PCR樣品進行瓊脂凝膠電泳檢測。

1.5 細菌生長曲線

挑取平板上單菌落接種于LB營養肉湯培養基，37℃搖床中培養過夜。將該菌液1∶1 000接種于新鮮培養基，將培養基置于37℃搖床中，每隔1 h取出，吸取100μL，用酶標儀測定OD600nm，設置3個重復，繪制細菌的生長曲線。

1.6 藥敏試驗

采用K-B藥敏紙片擴散法進行細菌藥敏試驗，挑取單菌落于LB肉湯培養基中，37℃搖床培養過夜。第二天1∶100接種于新鮮培養基中，37℃培養至OD為0.6時，制備細菌懸液，并均勻涂布于LB營養瓊脂平板中，將藥敏紙片貼于平板表面，重復3個平行，37℃培養18～24 h，測量抑菌圈大小。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的培養特性

由圖1可知，菌落在麥康凱瓊脂培養基上呈現出粉紅色圓形菌落、邊緣整齊、表面光滑濕潤。

圖1 分離菌株在麥康凱培養基的培養結果

革蘭氏染色鏡檢顯示為單個或成對存在，無芽孢，有菌毛，粉紅色的兩端鈍圓短小桿菌，該細菌為革蘭氏陰性桿菌，呈無規則雜亂排列（圖2）。

圖2 分離菌株的革蘭氏染色結果

2.2 PCR鑒定結果

從平板挑取菌落接入LB肉湯培養基中，提取菌株DNA作為模板，分別用大腸桿菌K88、K99、987P引物進行PCR擴增，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析后，分離菌株用K88引物擴增出目的條帶，且與預期片段大小相符，其他引物擴增結果均為陰性（圖3）。BLAST序列比對結果表明，分離菌株序列與產腸毒素大腸桿菌同源性最高。利用產腸毒素大腸桿菌菌毛保守基因進行了進化樹分析，表明分離菌株K88-HB202001與產腸毒素大腸桿菌K88同源性在98.05%～99.51%，表明所分離菌株為產腸毒素大腸桿菌K88，命名為K88-HB202001（圖4）。

圖3 分離菌株PCR鑒定結果

圖4 分離菌株基因進化樹

2.3 生長曲線

從圖5可以看出，分離株產腸毒素大腸桿菌K88-HB202001在10 h后進入生長平臺期，細菌濃度趨于穩定，與對照菌株ETECK88生長趨勢一致。

圖5 生長曲線結果

2.4 藥敏試驗結果

對分離菌株進行藥敏試驗，結果表明，菌株K88-HB202001，敏感藥物主要為喹諾酮類、氨基糖苷類、頭孢類，占比38%，尤其對環丙沙星、諾氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、頭孢拉定敏感；中度敏感藥物主要是多肽類、硝基呋喃類、氨基糖苷類，占比31%，主要為恩諾沙星、氧氟沙星、新霉素、多粘菌素B、呋喃唑酮等；耐藥藥物主要為青霉素類、四環素類、氯霉素類、磺胺類，占比31%，主要有阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考、四環素、多西環素、磺胺異惡唑等（表2）。

表2 藥敏試驗結果

3 小結與討論

在自然界中，大腸桿菌廣泛存在于人和動物腸道、呼吸道以及土壤、水、農產品中，是一類重要的人畜共患病原菌［4-9］。當人或動物機體抵抗力下降或當攜帶某些毒力因子的大腸桿菌侵入腸道和呼吸道外組織或其他器官時，就會引起感染。其中產腸毒素大腸桿菌是引起新生和斷奶仔豬腹瀉的最重要的病原之一，所引起的動物腹瀉類疾病嚴重影響畜牧業生產和發展［10-13］。本研究采集臨床腹瀉仔豬的腸道，通過選擇性培養基、菌落形態、革蘭氏染色及PCR擴增與測序等方法對細菌進行了鑒定，表明分離菌株為產腸毒素型大腸桿菌K88。

近年來，抗生素的不規范使用，不斷有新耐藥菌株產生的報道，且多重耐藥現象也愈來愈嚴重，嚴重危害畜產品安全和人類健康，對中國畜牧業的發展和公共衛生安全造成一定的影響。吳翠蓉等［14］通過對四川、廣西、貴州等地區的調查，發現大腸埃希菌呈現出耐藥性強、耐藥譜廣的現象，對四環素的耐藥率甚至高達100%，分析可能與四環素類藥物在中國使用時間較長、應用范圍較廣有關。湯景元等［16］對規模養豬場分離的480株大腸桿菌進行19種抗菌藥物的藥敏試驗，50%的菌株耐13種抗生素，14株對19種抗生素全部耐藥。于阿芳［17］利用24種常用抗生素對山東省分離的76株大腸桿菌進行了耐藥性研究，發現菌株對AM耐藥性最強，其次是TE、FFC、KAN、GM，對頭孢類藥物比較敏感。本研究選用16種常見抗生素對所分離菌株K88-HB202001進行了藥物敏感性試驗，結果顯示分離菌株K88-HB202001對阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考、四環素、多西環素、磺胺異惡唑等青霉素類、四環素類、氯霉素類、磺胺類藥物耐藥，對環丙沙星、諾氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、頭孢拉定等喹諾酮類、氨基糖苷類、頭孢類藥物敏感，為豬場選取精準藥物進行疫病治療提供了依據［18-20］。