基于網絡藥理學的核桃防治老年癡呆功能成分及其作用靶點研究

許成梅，陳 丹，徐冬月，趙慶宇婧，林玉萍，趙聲蘭

（1.云南中醫藥大學中藥學院，昆明 650500；2.云南省煙草質量監督檢測站，昆明 650106；3.昆明海關技術中心，昆明 650200）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s Disease，AD）俗稱老年癡呆（dementia），是一種發生于中老年的以進行性認知障礙和記憶能力下降為主的退行性神經病變，是繼心腦血管疾病和惡性腫瘤之后，老年人致殘、致死的第三大疾病。中國60歲以上的人口中，70%～80%伴有不同程度的健忘和癡呆，是世界上患者人數最多的國家［1］，嚴重危害和影響國人健康。AD的發病機制至今尚不明確，中醫理論認為“以腎虛髓虧為本，痰瘀阻滯為標，五臟失調，腦髓失用”為老年癡呆之病機［2］。傳統健腦藥食同源核桃（Jug?lansregiaL.）仁營養豐富，古典記載“胡桃仁頗類其狀”［3］，藥典收載的功能為“補腎，溫肺，潤腸，用于腎陽不足、腰膝酸軟、陽痿遺精、虛寒喘嗽、腸燥便秘”［4］，可用于防治老年癡呆［5-7］。核桃成分復雜多樣，本研究通過網絡藥理學方法分析核桃防治AD的作用成分及其靶點和機制，為核桃仁用于老年病癡呆防治提供更多的科學依據。

1 材料與方法

1.1 核桃活性成分及潛在靶點的篩選

通過TCMSP（Traditional Chinese Medicine Sys?tems Pharmacology）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）數據庫［8］和相關文獻獲得核桃的化學成分及相應潛在靶點。口服生物利用度（OB）反映藥物口服進入體循環的比例［9］，類藥性（DL）是根據混合物的結構和性質表征成藥特性，用于藥物發現早期的初篩［10］。通常以OB≥15%和DL≥0.18作為篩選標準。此外，血腦屏障（BBB）是大腦與身體其他部位之間的高度選擇性物理屏障，但它也阻止了許多治療藥物進入大腦參與反應，從而使疾病的治療很困難。因此，它也是藥物選擇的重要參數。但隨著年齡的增長以及神經血管和神經退行性疾病的發生，血腦屏障的通透性會有所增加［11］。

1.2 AD靶點搜集

使 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、TTD（Therapeutic Target Database）（https：//db.idrblab.org/ttd/）和OMIM（https：//omim.org/）3個數據庫［12］，以“Alzheimer′s Disease”和“dementia”為關鍵詞搜索老年癡呆相關靶點，將3個數據庫的靶點進行歸并得到老年癡呆的靶點，以評分≥5為篩選條件，獲得AD相關靶點。

1.3 潛在靶點分析

將核桃的潛在靶點與AD相關的靶點通過R3.6.2軟件取交集，即為核桃作用于AD的潛在靶標。

1.4 網絡構建

將交集靶點信息整理成Excel軟件中的格式導入網絡可視化軟件Cytoscape3.7.2（http：//cytoscape.org/，v3.7.2）構建核桃“活性成分-藥物-疾病-靶點”網絡圖，并運用Meta-analysis和Network Analyzer插件分析網絡拓撲參數：選取節點度（Degree）前三位的活性成分為主要活性成分［13］，進一步了解核桃活性成分與AD相關靶點的相互作用關系。目前，STRING（Search Tool for Recurring Instances of Neigh?bouring Genes）是蛋白質相互作用覆蓋種類最多的數據庫［14］，將交集靶點導入STRING（https：//stringdb.org/）在線分析平臺以獲得蛋白質-蛋白質相互作用網絡（Protein Protein Interaction Network，PPI）。蛋白質-蛋白質相互作用評分的置信度設置為0.900，并隱藏無相互作用的蛋白。將獲得的PPI數據導出為TSV文件格式并導入到Cystoscape 3.7.2軟件繪制網絡圖，利用Metascape和CytoNCA插件對其進行拓撲學分析，包括度中心性（DC）、特征向量（EC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC），各值越大代表該點在網絡圖中越重要，取DC、EC、BC、CC值大于其2倍中位數進行關鍵靶點篩選［15］。

1.5 GO功能富集和KEGG信號通路分析

使用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數據庫進行GO功能富集和KEGG信號通路分析。主要進行細胞、分子和生物三方面功能富集分析，以統計學超幾何分布定量（P）評估相關性，設置P<0.01。

2 結果與分析

2.1 核桃活性成分篩選結果

以OB%≥15%，DL≥0.18為篩選標準，從TCMSP數據庫獲得核桃活性成分14種。相關文獻報道核桃中許多其他成分可改善記憶衰退，預防AD，如芥子酸（Sinapic acid）、咖啡酸（Caffeic acid）、兒茶素（Catechin）、褪黑素（Melatonin）、丁香酸（Syringic acid）、槲皮素（Quercetin）、α-亞麻酸（alpha-Linolenic acid）、香豆酸（Coumaric acid）、亞油酸（Linoleic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、油酸（Oleic acid）、沒食子酸（Gallic acid）、維生素E（Vitamin E）、綠原酸（Chlorogenic acid）和蘆丁（Rutin）（OB：64.15%、54.97%、54.83%、52.96%、47.78%、46.43%、45.01%、43.29%、41.90%、39.56%、33.13%、31.69%、14.26%、13.61%、3.20%；DL：0.08、0.05、0.24、0.11、0.06、0.28、0.15、0.04、0.14、0.06、0.14、0.04、0.55、0.31、0.68）［16-26］。綜合數據庫搜索和文獻報道，最終獲得核桃活性成分29種（表1）。

表1 核桃潛在活性成分

2.2 核桃作用于AD的潛在靶點

基于所獲得的29種化合物進行搜索，得到鞣花酸、2，2′，3，3′，4，4′-四甲氧基-6，6′-聯苯二甲酸二甲酯、α-亞麻酸、咖啡酸、兒茶素、綠原酸、香豆酸、阿魏酸、沒食子酸、亞油酸、褪黑素、油酸、槲皮素、蘆丁、芥子酸、丁香酸和維生素E共17種化合物具有潛在靶點365個。從GeneCards和OMIM數據庫獲得2 645個與AD相關的靶點基因（評分≥5）。通過R3.6.2軟件將AD相關靶點基因和核桃的成分潛在靶點相交，結果顯示核桃成分的159個潛在靶標與AD相關（表2）。

表2 核桃成分中與AD相關的潛在靶點

2.3 網絡構建

通過Cytoscape 3.7.2軟件構建核桃“活性成分-藥物-疾病-靶點”網絡（圖1）。該網絡包含278個節點，核桃活性成分17個，作用靶點159個，423條相互作用的邊。作用靶點最多的成分為槲皮素、油酸、鞣花酸、蘆丁和阿魏酸；受最多化合物作用的靶點為前列腺素過氧化物合成酶（PTGS1/2）、視黃酸受體（RXRA）、轉錄因子p65（RELA）、單胺氧化酶（MAOB）和一氧化氮合酶（NOS3）等。表明核桃通過多成分、多靶點共同作用來防治AD。

圖1 核桃活性成分-靶點網絡

續表2

將159個靶基因輸入STRING數據庫進行分析，獲得靶點蛋白相互作用關系網絡（圖2）。關鍵蛋白為RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、絲裂原激活蛋白激酶1（MAPK1）、轉錄因子AP-1（JUN）、轉錄因子p65（RELA）、白介素-6（IL6）等（圖2）。這些蛋白可能在核桃防治AD中起關鍵作用。

圖2 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖（上）和關鍵蛋白排序（下）

2.4 GO功能富集分析

采用DAVID數據庫，對核桃的159個AD相關靶點進行細胞、分子和生物3個方面功能進行富集分析（P<0.01）（圖3）。其中，細胞成分主要涉及細胞外間隙（P=2.19E-24）、胞外區（P=3.01E-12）、細胞溶質（P=9.45E-09）、質膜（P=7.85E-07）和小窩（P=1.47E-06）等；分子功能主要涉及酶結合（P=5.03E-19）、相同的蛋白質結合（P=2.20E-16）、蛋白質同二聚化活性（P=3.22E-14）、蛋白質異二聚化活性（P=1.00E-11）和蛋白質結合（P=4.88E-11）等；生物過程主要包括對藥物的反應（P=1.91E-23）、老化（P=4.10E-18）、對缺氧的反應（P=1.62E-16）、細胞增殖的正調控（P=4.15E-16）和凋亡過程的負調控（P=4.15E-16）等，表明相關靶點通過調控不同生物學功能作用于AD。

圖3 GO功能富集結果

2.5 KEGG通路分析

對核桃的159個AD相關靶點進行KEGG通路富集分析（P<0.01），篩選得到160條相關通路，前30條重要通路見圖4。其中，尿病并發癥中的AGERAGE信號通路（P=7.88E-25）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化（P=6.40E-22）、PI3K-Akt信號通路（P=5.93E-16）、白細胞介素-17信號通路（P=3.77E-15）、HIF-1信號通路（P=4.91E-15）、TNF信號通路（P=8.51E-15）可能為核桃不同成分作用于AD的關鍵通路。

圖4 KEGG通路分析結果

3 討論

網絡藥理學以系統生物學為基礎，系統闡述藥物成分與機體相互作用的原理與規律，可用來預測中藥單體［27］或復方［28］的各有效成分及其作用靶點和參與的相關通路，探索藥物與疾病間的關聯性，解釋中藥治療疾病的作用機制。本研究應用網絡藥理學方法篩選得到核桃17種活性成分具有AD相關的潛在靶點159個，主要為酚類、脂肪酸、黃酮類化合物。槲皮素、油酸、鞣花酸、蘆丁和阿魏酸等顯示出較強的靶向作用，均可改善認知，延緩記憶衰退。槲皮素可減輕大鼠記憶障礙，其機制可能與調節海馬和前額葉皮質中Copine 6和TREM1/2的BDNF相關表達失衡有關［26］。鞣花酸具有神經保護作用，它可以改善AD相關的認知障礙，可能是由RAC-ine絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶/糖原合酶激酶3β（AKT1/GSK3β）信號介導的［22］。本研究獲得的PTGS1/2、RXRA、RELA、MAOB和NOS3可能是AD的關鍵靶點。RXR是膽固醇合成和代謝的關鍵調節劑，RXRA是核配體激活的轉錄因子家族的成員，AD患者的膽固醇代謝會發生改變，RXRA基因變異可能通過影響腦膽固醇代謝而成為AD的危險因素［29］。在AD的淀粉樣斑塊周圍可觀察到反應性星形膠質細胞，反應性星形膠質細胞通過MAOB異常而產生抑制性膠質遞質GABA，在AD模型小鼠的齒狀回釋放的GABA通過作用于突觸前GABA受體而降低顆粒細胞的刺激率；在AD患者死后，腦中GABA和MAOB顯著上調，選擇性抑制GABA的合成或釋放可能是治療AD記憶障礙的有效策略［30］。認知障礙大鼠白細胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子ɑ（TNF-ɑ），誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達顯著增加，且炎癥因子水平與Aβ42沉積呈正相關［31］，所涉及的靶點均為本研究中發現的AD相關重要靶點。

KEGG通路分析獲得的一條重要通路為尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路，AD與糖尿病關系密切，具有相似的病理改變，被稱為“第3種糖尿病”［32］。研究表明，糖尿病腦病的特點是認知障礙、神經化學和結構異常，可通過下調BACE1、抑制AGE/RAGE軸和腦內炎癥進行改善［33］。PI3K/Akt信號通路通過發揮抗氧化、抗炎和神經保護作用而在調節AD中起重要作用［34］。β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積是AD的發病機制之一，AD的發生與缺氧有一定關系。在分子水平上，缺氧應答主要靠HIF-1進行調節和介導，HIF-1的高表達可以通過與BACE1啟動子結合，繼而誘導BACE1的表達并導致Aβ水平升高［35］。

盡管目前AD的發病機制尚不明確，核桃的健腦功能也有待開發，但借助網絡藥理學研究顯示核桃可從多成分、多靶點、多途徑協同干預AD的發生和發展，其中作用靶點最多的成分為槲皮素、油酸、鞣花酸、蘆丁和阿魏酸，受最多化合物作用的靶點為前列腺素過氧化物合成酶、視黃酸受體、轉錄因子p65、單胺氧化酶和一氧化氮合酶，為核桃防治AD的功能成分和靶點機制提供了數據和理論支持。