蛋白酶K的突變及其性質研究

王 穎，劉曉艷，閔 勇，周榮華，饒 犇

（湖北省生物農藥工程研究中心，武漢 430064）

蛋白酶是一類水解蛋白質肽鏈的酶，廣泛存在于微生物、動物內臟和植物莖葉、果實中［1］。早在20世紀初，美國首次將木瓜蛋白酶用于啤酒的澄清處理，而在20世紀30年代第一次將微生物蛋白酶用于食品行業［2］，隨著科技水平的提高，越來越多的蛋白酶被發掘出來，并被廣泛應用于各行各業，如食品加工、皮革制造、洗滌劑以及分子生物研究等領域［3-5］。

蛋白酶K是蛋白酶的一種，屬于堿性絲氨酸蛋白酶類，來源于林伯氏白色念球菌（Tritirachium al?bumLimber）。首次由Hennrich等于1973年報道，因其能降解角蛋白，故命名為蛋白酶K；1974年Ebeling等［6］通過凝膠過濾大致確定其分子質量為（18 500±500）Da，等電點（pi）為8.9，最適pH在7.5～12.0，是一種堿性蛋白酶。蛋白酶K的蛋白序列由Jany等［7］于1985年報道，晶體結構由Pahler等于1984年初次報道，蛋白質準確大小由Gunkel等［8］于1989年報道，蛋白酶K的基因有2個外顯子編碼，含有一個63 bp長的內含子；蛋白質由15個氨基酸組成的信號肽、90個氨基酸組成的前導肽和279個氨基酸組成的成熟肽組成［7］。蛋白酶K具有2個Ca2+結合位點，若用乙二胺四乙酸螯合蛋白酶K中的Ca2+，處理3 h其活性降低50%，而加入Ca2+復性處理，其酶活只有初始酶活的28%；此外，其成熟體還含有典型的絲氨酸蛋白酶類催化三聯體結構（Asp 39-His 69-Ser 224）和兩對二硫鍵［8］。有研究指出，蛋白酶K對尿素具有較強的耐受性，低濃度十二烷基硫酸鈉（SDS）對其活性影響較低，高濃度影響較大，PMSF對其活性具較強的抑制作用［7，8］。

目前對蛋白酶K的研究主要集中在提高蛋白酶K活性、產量，以及其在各行業中的應用。本研究通過文獻調研與在線軟件TSpred預測對蛋白酶K活性具有潛在影響的3個氨基酸殘基位點，對這些位點進行定點誘變，并將這些突變基因在畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115中進行表達，對表達得到的蛋白質進行分析，篩選比酶活和熱穩定性均得到提高的蛋白酶K突變體。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養基

Escherichia coliTop-10、載 體pPicZαA、酵 母GS115均為Invitrogen公司產品。大腸桿菌（Escherich?ia coli）使用LB培養基培養，畢赤酵母使用BMGY、BMMY培養基培養，具體配方見Invitrogen手冊。

1.2 蛋白酶K表達質粒的構建及突變體的構建

從NCBI上面查詢到蛋白酶K序列PK（GenBank：P06873.2），在上海生工進行了基因合成，利用2個酶切位點EcoRI和NotI將PK克隆至pPicZαA表達載體上，得到重組質粒pPicZαA-PK。蛋白酶K突變體的構建主要是根據具體的氨基酸突變位點，在引物上引入突變堿基，然后利用PCR的方法對基因進行點突變，分別得到突變質粒pPicZαA-PK108、pPicZαAPK199和pPicZαA-PK238。

1.3 蛋白酶K在畢赤酵母中的表達

在大腸桿菌中構建好表達質粒，進行酶切和測序鑒定，然后大量提取質粒，利用PmeI進行線性化，電轉化畢赤酵母感受態，然后挑取重組子進行搖瓶發酵，電轉換條件和搖瓶誘導條件均根據Invitrogen手冊實現。

1.4 蛋白酶K及其突變體蛋白活性定義及測定

在一定溫度和pH條件下，在1 min內水解酪蛋白產生1μg酪氨酸的酶量為1個酶活單位，以U表示。蛋白酶K在一定溫度和pH條件下，水解酪蛋白產生含有酚基的酪氨酸，在堿性條件下，可將Folin試劑還原，生成鉬藍和鎢藍，其顏色的深淺與酪氨酸的含量成正比。通過在680 nm處測定其吸光度，得到酶解產生酪氨酸的量，進而計算蛋白酶K的活力。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶K表達質粒p Pic ZαA-PK的構建

以上海生工合成好的蛋白酶K基因為模版，用引物PKF和引物PKR進行PCR擴增獲得蛋白酶K基因（圖1），然后用限制性內切酶EcoRI和NotI分別處理載體pPicZαA和PK片段，連接克隆后得到重組質粒，命名為pPicZαA-PK。

圖1 PCR擴增蛋白酶K基因

2.2 蛋白酶K突變體表達質粒的構建

根據蛋白酶K氨基酸序列，通過網站（http：//co?spi.iiserpune.ac.in/TSpred/）對其活性位點進行了分析，選取了3個位點的氨基酸（108I、199L、238M）進行飽和突變，其中突變位點氨基酸密碼子根據畢赤酵母蛋白表達密碼子偏愛性進行了優化。例如，將蛋白酶K基因第108位I突變成G，用引物PKF、PK108F、PK108R、PKR（表1）對蛋白酶K基因進行搭橋PCR得到目的片段PK108，然后將該片段克隆至pPicZαA載體上，命名為pPicZαA-PK108，根據該方法，還構建了pPicZαA-PK199和pPicZαA-PK238。

表1 用于構建野生型及突變體的引物

2.3 蛋白酶K及其突變體重組子的轉化及篩選

將蛋白酶K及其突變體質粒用SacI線性化，純化后電轉化Pichia pastorisGS115感受態細胞，涂布MD平板，然后酪素底物平板篩選，如圖2所示，選取水解圈大的菌株進行下一步試驗。

圖2 酪素平板篩選蛋白酶K重組子

2.4 蛋白酶K的搖瓶表達

將篩選到的蛋白酶K重組菌株進行搖瓶表達，先用200 mL BMGY培養基富集培養至OD600nm為8～12（40～48 h），離心（4 000 r/min，5 min）棄上清液，加入50 mL BMMY培養基重懸，加入1%體積甲醇進行誘導，誘導72 h，每12 h加1次甲醇。待誘導結束后，離心（6 000 r/min，5 min）收集培養基上清液，用0.22μm濾膜過濾4℃短期保存，并通過SDS-PAGE檢測蛋白酶K的表達情況（圖3），之后用BCA試劑盒對發酵液的蛋白質濃度進行測定，結果顯示其濃度為1.5 mg/mL。

圖3 不同誘導時間蛋白酶K的表達量（SDS-PAGE檢測）

2.5 蛋白酶K及其突變體的性質對比

比較了蛋白酶K野生型菌株和3個突變菌株在最適條件下（pH 5.0、40℃）的比酶活變化，結果（表2）表明，第108位氨基酸的突變可以顯著提高蛋白酶K的活性，其他2個位點的突變則起了負效應；除此之外，還比較了幾個突變子在50℃的熱穩定性，突變子pPicZαA-PK108顯示出了更高的熱穩定性，該突變子比野生型表現了更好的應用前景。

表2 野生型蛋白酶K及其突變體的酶活性比較

3 小結

林伯氏白色念球菌來源的蛋白酶K（EC3.4.21.64），自1973年首次被發現以來，有研究者對其結構、性質進行了研究報道［5］，并實現了蛋白酶K的異源表達（主要是大腸桿菌和畢赤酵母）。此外，研究者們還對如何提高蛋白酶K的表達量、比活性，以及在研究中的最適用量與處理時間（如在原位雜交中的最適用量與處理時間）等方面進行了研究［6-8］，極大程度地促進了蛋白酶K在工業與科研中的應用。

本研究首先獲得了野生型的蛋白酶K表達菌株，然后通過軟件預測得到了對其熱穩定性具有潛在影響的3個氨基酸殘基位點，對它們進行了點突變，分別在畢赤酵母GS115中進行了分泌表達，通過篩選獲得了一個熱穩定性提高了30%，比活性提高約50%的蛋白酶K突變體pPicZαA-PK108。這對蛋白酶K在工業上的應用起到了一定的促進作用，如可以減少蛋白酶K在洗滌劑、食品加工中的用量，降低生產成本；此外，也可提高污水中病毒的滅活效率，減少環境污染。