Alternaria perpunctulata NBERC_H56菌株對馬唐的除草活性及其次級代謝產物的分離鑒定

吳兆圓，任夢瑤，張志剛，劉 芳，張亞妮，方 偉

（1.湖北省生物農藥工程研究中心，武漢 430064；2.武漢科技大學醫學院，武漢 430081）

利用微生物及其代謝產物來開發新型除草劑是國內外研究的熱點之一，而從罹病的雜草植株上分離強致病性的病原菌則是發掘微生物（源）除草劑的主要手段［1］。其中利用最多的是植物病原真菌，有超過40個屬的真菌已經或者正在被考慮開發成生物除草劑［2］。馬唐（Digitaria sanguinalis）是禾本科單子葉植物，是一種秋熟作物農田中的雜草，在熱帶和溫帶地區的36個國家均有分布，對30多種農作物的生產有嚴重危害［3］。國外有報道利用彎孢屬病原真菌Curvularia intermedia［4］及馬唐黑粉菌（Ustilago synthersmae）［5］作為馬唐生防菌劑。在國內，海南大學利用新月彎孢菌（Curvularia lunata）［6］，南京農業大學利用畫眉彎孢菌（Curvularia eragrostidis）［7］，浙江師范大學利用從馬唐罹病葉片上分離得到的炭疽菌Colletotrichum hanaui［8］進行 了對 馬 唐的 防 治研究，均取得一定效果。盡管已報道的對馬唐有致病性的菌株有很多，但是真正商品化的防除馬唐的微生物制劑種類相對較少。因此，繼續篩選馬唐生防菌株能夠為研發新型、高效的生物除草劑提供微生物品種資源，具有重要的科學意義和廣泛的應用前景。湖北省生物農藥工程研究中心課題組從罹病的馬唐植株上分離得到1株病原真菌NBERC_H56，經鑒定為鏈格孢屬真菌Alternaria perpunctulata，并發現其發酵液對馬唐幼苗的生長具有明顯的抑制作用，盆栽噴霧14 d試驗結果顯示對馬唐鮮重的抑制率為75.6%。為明確菌株NBERC_H56的除草活性物質基礎，對菌株進行了大量發酵、提取以及分離純化，并經LC-MS和NMR鑒定，現將試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和主要試劑

Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內標，δ為mg/L，J為Hz）（德國Bruker BioSpin公司）；Bruker APEX DUO單晶衍射儀（銅靶衍射）（德國Bruker BioSpin公司）；Waters 2695液質聯用儀（美國Waters公司）；Waters 2767高效液相制備儀（Waters 2525泵，帶2767自動收集系統，2996二級管陣列檢測器，色譜工作站Masslynx V4.0）；美國Sunfire C18 OBD制備柱（5μm，19 mm×250 mm/10 mm×250 mm，愛爾蘭）；100～200目柱色譜填料柱層析硅膠（青島海洋化工廠）。分離提取試劑乙酸乙酯為中國醫藥集團有限公司生產，HPLC制備用乙腈為湖北弗頓科學技術有限公司生產。

1.2 馬唐致病真菌的分離

菌株分離自湖北省武漢市郊區烏龍泉馬唐罹病植株（2020年6月采樣），現菌種保存在湖北生物農藥工程研究中心，編號NBERC_H56。

將馬唐罹病植株用乙醇浸泡15 s，無菌水漂洗3次，用滅菌濾紙吸干殘留水分后剪碎，置于研缽中搗碎，隨后加入5 mL無菌水，取0.1 mL混合液于裝有PDA培養基的培養皿中涂勻，28℃恒溫保濕培養，每天觀察菌種生長情況，待菌體長出后，挑選菌株邊緣菌絲進行培養，如此反復至得到純凈的菌體。

1.3 菌株的培養及活性測試

NBERC_H56發酵培養基：麥芽糖6.25 g/L，麥芽提取物6.25 g/L，酵母提取物1.0 g/L，蛋白胨0.625 g/L，磷酸二氫鉀1.25 g/L，硫酸鎂0.625 g/L，pH調至7.0。

將NBERC_H56菌株接種于已滅菌的裝有100 mL上述培養基的250 mL錐形瓶中，加入0.3%瓊脂，于28℃靜置培養7 d。

選取營養狀態相同、4葉期馬唐，取適量菌株發酵液采用噴霧法對馬唐幼苗進行噴灑（90 mL/m2），以含0.1%吐溫-80的無菌水作為空白對照，每次試驗設3個重復，每個試驗重復3次，28℃，光照強度8 000 lx。14 d后對株高、根長進行測量，對鮮重進行稱量，計算抑制率。抑制率=［（對照平均株高或根長或鮮重-處理平均株高或根長或鮮重）/對照平均株高或根長或鮮重］×100%。

1.4 菌株的大量發酵、提取及次生代謝產物分離純化

按照上述培養基及培養條件發酵100瓶（10 L），發酵完成后合并發酵液，加入10 L的乙酸乙酯攪拌提取3次，提取液過濾后真空濃縮得到提取物1.45 g。提取物用少量甲醇溶解，經硅膠柱色譜進行柱層析，用石油醚/乙酸乙酯進行梯度洗脫，洗脫組分通過HPLC檢測合并為6段（Fr.1至Fr.6）。主要組分Fr.4（1.06 g）經制備色譜柱（Sunfire C18 OBD制備柱，5μm，19 mm×250 mm，24 mL/min）進行分離，洗脫梯度為5%～100%乙腈，洗脫40 min。

2 結果與分析

2.1 菌株NBERC_H56的除草活性

如表1、圖1所示，菌株NBERC_H56發酵液（簡稱H56發酵液）盆栽噴霧14 d對馬唐幼苗的株高、根長及鮮重有明顯的抑制作用，抑制率分別為55.6%、45.1%和75.6%。

表1 菌株NBERC_H56發酵液對馬唐的株高、根長以及鮮重的抑制率

圖1 菌株NBERC_H56發酵液對馬唐的生長抑制作用

2.2 化合物的結構鑒定

洗脫組分通過HPLC檢測、分離、純化，得到化合物1（7.89 mg）、化合物2（8.86 mg）和化合物3（6.50 mg），其結構如圖2所示。

圖2 菌株NBERC_H56產生的化合物結構

化合物1：淡黃色粉末，分子式為C12H14O5，分子量 為238.2；1H NMR（C2D6SO，500 MHz）δ：6.31（1H，d，J=2.1 Hz，H-6′），6.15（1H，d，J=2.1 Hz，H-4′），4.04（2H，dd，J=14.2，7.1 Hz，H2-1″），3.47（2H，s，H2-2），2.40（3H，s，H3-8′），1.18（3H，t，J=7.1 Hz，H3-2″）；13C NMR（C2D6SO，125 MHz）δ：202.6（s，C-7′），171.4（s，C-1），160.2（s，C-3′），158.8（s，C-5′），136.2（s，C-1′），120.1（s，C-2′），111.1（d，C-6′），102.1（d，C-4′），60.4（t，C-1″），39.53（t，C-2），32.6（q，C-8′），14.6（q，C-2″）。以上核磁數據與文獻［9］報道的Curvulin的核磁數據基本一致，確定該化合物為Curvulin。

化合物2：黃色油狀物，分子式為C14H10O5，分子量為258.3；1H NMR（C2D6SO，500 MHz）δ：7.24（1H，d，J=1.8 Hz，H-6），6.72（1H，d，J=2.4 Hz，H-5′），6.64（1H，d，J=2.4 Hz，H-3′），6.36（1H，d，J=1.8 Hz，H-4），2.71（3H，s，H3-7′）；13C NMR（C2D6SO，125 MHz）δ：166.4（s，C-4），165.2（s，C-7），165.2（s，C-5），164.6（s，C-3），159.0（s，C-4′），153.1（s，C-2′），138.8（s，C-6′），138.6（s，C-1），118.0（s，C-5′），109.5（s，C-1′），105.0（d，C-6），102.1（d，C-3′），101.5（d，C-4），97.6（s，C-2），25.7（q，C-7′）。以上核磁數據與文獻［10］報道的Alternariol的核磁數據基本一致，確定該化合物為Alternariol。

化合物3：淡黃色粉末，分子式為C15H22O4，分子量 為266.3；1H NMR（C2D6SO，500 MHz）δ：6.91（1H，s，H-6），5.45（1H，t，J=6.7 Hz，H-2′），4.57（2H，d，J=3.4 Hz，H2-7），4.54（2H，d，J=6.7 Hz，H2-1′），4.49（2H，s，H2-8），3.65（3H，s H3-9），2.05（3H，s，H3-10），1.76（3H，s，H3-4′），1.72（3H，s，H3-5′）；13C NMR（C2D6SO，125 MHz）δ：158.2（s，C-3），157.5（s，C-7），165.2（s，C-5），141.9（s，C-1），137.3（s，C-3′），120.7（s，C-2），120.3（s，C-4），117.0（d，C-3′），106.8（d，C-6），65.1（t，C-1′），63.6（t，C-7），61.9（q，C-9），60.6（t，C-8），26.0（q，C-4′），18.5（q，C-5′），9.6（q，C-10）。以上核磁數據與文獻［11］報道的Zinniol的核磁數據基本一致，確定該化合物為Zinniol。

3 討論

通過篩選，本課題組從罹病的馬唐植株上分離得到1株鏈格孢屬雜草病原真菌Alternaria perpunct?ulataNBERC_H56，活性測試結果表明其發酵液對馬唐幼苗的生長具有明顯的抑制作用，并且從菌株NBERC_H56的次級代謝產物中得到化合物Curvu?lin（1）、Alternariol（2）和Zinniol（3）。據文獻報道，Curvulin（1）主要由內臍蠕孢屬（Drechslera）和彎孢屬病原真菌產生［9］，對馬齒莧（Portulaca oleracea）和刺莧（Amaranthus spino）具有植物毒性［12］，而Alter?nariol（2）和Zinniol（3）均為鏈格孢屬真菌產生的植物毒素［11，13］，由此可初步推斷化合物1、化合物2和化合物3均為菌株NBERC_H56產生除草活性的物質基礎。

本次試驗首次發現鏈格孢菌Alternaria perpunct?ulata對馬唐具有生長抑制作用，并且首次對該菌的次級代謝產物進行了研究，分離得到3個具有除草活性的化合物，初步闡明了活性物質基礎，下一步可對菌株NBERC_H56的除草活性進行深入研究，為真菌源除草劑的發現提供良好的研究基礎。