蝦稻共作田有機質降解菌的篩選和評價

鄭嬌莉，姚經武，黃大野，楊 丹，王蓓蓓，曹春霞

（湖北省生物農藥工程研究中心，武漢 430064）

蝦稻共作是一種新型的綠色養殖模式，利用稻田淺水環境和冬閑期進行克氏原螯蝦養殖，水稻種植過程中減少化肥和農藥的使用［1，2］。蝦稻共作模式下春季克氏原螯蝦生長旺盛、養殖密度高、投餌量加大，導致池塘底質環境急劇惡化，有機物腐敗大量耗氧，并產生硫化氫、氨氮和亞硝態氮等有毒有害物質，從而導致克氏原螯蝦免疫力降低，蝦病廣泛暴發［3-5］，底質改良被認為能夠有效改善蝦稻共作養殖環境［4］。

微生物修復（Microbial remediation）是指利用微生物的吸收、轉化、降解作用清除環境中污染物的一個受控或自發的過程［6］。微生物技術廣泛應用于水產養殖環境的改良和修復，微生物菌劑能夠抑制水體中有害微生物的生長、分解殘餌廢料和動物排泄物等有機質、維持養殖水體微生態平衡、增強養殖動物免疫力和促進生長等功能。然而由于中國水產養殖環境變化很大，養殖種類豐富，微生物菌劑在使用過程中存在針對性和適應性差等缺點，影響使用效果，因此從養殖環境篩選本土益生菌，開展本土菌株在養殖池塘污染調控及有益菌制劑的研發受到重視［7-9］，從南美白對蝦養殖池塘中分離篩選出1株凝結芽孢桿菌（Bacilluscoagulan），并研究了該芽孢桿菌的生長特性［10］，閆法軍等［8］從刺參養殖池塘中篩選出3株低溫降解菌，其對氨氮的去除率均高達95%以上，去除餌料浸出液中的COD為21.0%～50.0%，李步先等［9］將蝦蟹混養池塘底泥中篩選的4株本土菌制備成混合菌劑，使用5 d后對COD的降解率達70%。

本研究針對蝦稻共作田的環境改良需求，從湖北省典型蝦稻共作環境中分離有機質降解菌，研究菌株的生長特性和降解性能，評價其應用前景，為蝦稻共作養殖環境的微生物修復提供菌種資源和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

于2020年6月采集自湖北省不同年限、不同地區的蝦稻共作田土壤樣品，使用土鉆采集5～10個表層20 cm土壤樣品，混勻后放入4℃冰箱保存。采樣點樣品信息如表1所示。

表1 采樣點樣品信息

1.2 有機質降解菌的分離和篩選

1.2.1 培養基配制1）富集培養基配方。取30 g蝦飼料充分研磨后加1 L無菌水，振蕩搖勻，密封后浸泡48 h以獲取上清液餌料的浸出液，離心后取出上清液進行抽濾，重復此操作2～3次，取上清液，調節pH 7.8，分裝滅菌。2）分離培養基。富集培養基1 L，瓊脂25 g，pH 7.8，121℃，滅菌后倒平板。

1.2.2 樣品處理 取底泥與無菌的生理鹽水以1∶9的比例進行混合，充分混勻后取上清液放在4℃冰箱里保存備用。

1.2.3 富集馴化 將制備好的樣品液接種于10 L無菌離心管，搖勻后90℃水浴20 min，盡可能除去其他微生物。然后分別將水浴處理后的各樣品液接種到富集培養基中，恒溫振蕩培養7 d，得到樣品的初始富集菌液。按1∶10的比例接種初始富集菌液于100 mL馴化培養基中繼續振蕩培養7 d，如此反復6個周期。

1.2.4 分離純化 取最后一次的富集液，采用平板涂布法，在分離培養基上進行菌株分離，涂布好后恒溫培養24～48 h，后挑去單菌落，在分離平板上進行劃線培養，直至獲得純化菌株，進行斜面劃線并將各菌株編號保種。

1.2.5 菌株篩選 取10 mL活化菌于無菌離心管中，90℃水浴20 min，取水浴后菌液，采用平板劃線法，挑選24 h內生長較好的菌株。試驗以富集培養基作為菌株降解溶液，以不加菌的富集培養基作為對照，測定菌株的有機質降解率，篩選降解率高的菌株。

1.3 菌株16S測序鑒定

采用通用引物對（27F/1492R）對菌株進行PCR，將PCR產物送測序公司測序，16S測序結果在NCBI上進行比對，對菌株進行鑒定。

1.4 有機質降解菌的生長和降解特性

挑取單菌落接種于LB培養液中，30℃、180 r/min過夜培養后，按照1%的比例接種于富集培養基中，每隔4 h取樣測定菌液的OD600nm，獲得不同菌株的生長曲線。

將培養過夜的LB菌液按照1%的比例接種于富集培養基中，分別于1、3、5、8 d后取樣測定培養基COD含量，從而獲得菌株的降解曲線。

1.5 有機質降解菌的胞外酶活性測定

胞外酶活性測定培養基參考郭燦燦等［11］的方法，用牙簽將搖培的LB培養液菌株點接在預先準備好的4種篩選平板上，每個處理4次重復，26℃培養48 h后測定水解圈直徑和菌落直徑。對于蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶，可以通過比較水解圈直徑/菌落直徑數值來初步判斷菌株分泌胞外酶能力的大小，該值越大，菌株產酶能力越強；脂肪酶則是通過比較菌落中形成的紅色斑點區的大小來判斷，紅色斑點區越大，產脂肪酶能力越強。

1.6 數據分析

采用SPSS17.0軟件進行數據統計，通過單因子方差分析和Duncan多重比較進行數據分析。各處理之間以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結果與分析

2.1 有機質降解菌的分離和篩選

經富集馴化，共分離純化獲得36株菌株，降解活性如圖1所示。其中，菌株編號2、7、20、26、28、35具有較高的降解活性，這些菌株分別分離自咸寧20年蝦稻田土壤、丫角4年蝦稻田土壤，樣點信息如表2所示，將菌株分別命名為OC-1至OC-6。

表2 初篩有機質降解菌基本信息

2.2 有機質降解菌的分類

對這些菌株進行16SrDNA序列分析，由圖2可以看出，OC-1至OC-6菌株均為芽孢桿菌，其中，OC-1、OC-2、OC-3 3株細菌均歸屬于阿氏芽孢桿菌（Bacillusaryabhattai）；OC-4初步鑒定為彎曲芽孢桿菌（Bacillusflexus）；OC-5初步鑒定為黃海芽孢桿菌（Bacillus marisflavi）；OC-6屬于芽孢桿菌（Bacillussp.）。

圖2 菌株OD-1至OD-6基于16Sr DNA序列的系統發育樹

2.3 有機質降解菌的生長特性

從6種菌株的生長曲線（圖3）可以看出，OC-1、OC-3、OC-4和OC-6生長更為迅速，在接種后16 h即可達到穩定期，而OC-2生長速率較低。值得注意的是OC-5菌株由于具有凝集特性，所以OD600nm測值偏低，在8～24 hOD600nm為0，需要用其他方法檢測其生物量。

圖3 有機質降解菌的生長曲線

2.4 有機質降解菌的氨氮去除特性

從表3可以看出，各菌株對氨氮有一定的去除效果，氨氮去除效果為28.89%～67.21%，培養4 d后OC-4和OC-6去除效果較低，分別為28.89%和30.67%，其余菌株的去除效果為50%左右。

表3 有機質降解菌的氨氮去除特性 （單位：%）

2.5 有機質降解菌的降解特性

菌株能夠快速降解餌料培養基中的有機質，如圖4所示。OC-1至OC-3降解速率較高，培養1 d降解率即達70%左右，3 d達90%以上，隨著時間逐漸增加，降解率反而有所下降，這可能是由于這些菌株生長快速，高濃度的菌株分泌一些有機代謝產物，從而增加了培養基中有機質含量。OC-4至OC-6降解速率相對較低，培養1 d降解率為50%左右，之后隨著培養時間的增加降解率逐漸升高，OC-4至OC-6降解率在培養3 d即達85%以上。

圖4 有機質降解菌的有機質降解特性

2.6 有機質降解菌的產酶能力

對各菌株的產酶特性進行研究［11］，結果見圖5、圖6、圖7。6株菌株均能產生胞外蛋白酶，以水解圈/抑菌圈來反映各菌株的蛋白酶活性，發現OD-1至OD-3具有相對較高的蛋白酶活性（圖5）；僅OD-1至OD-3具有產胞外淀粉酶的能力，3種菌株淀粉酶活性相差不大（圖6），而OD-4至OD-6沒有產胞外淀粉酶的能力；OD-1、OD-2和OD-4具有產胞外纖維素酶的能力，其中OD-4產胞外纖維素酶活性的能力更高（圖7），其余3株菌種不產胞外纖維素酶；此外，6種菌株均不產脂肪酶。

圖5 有機質降解菌產胞外蛋白酶特性

圖6 有機質降解菌產胞外淀粉酶降解特性

圖7 有機質降解菌產胞外纖維素酶降解特性

3 小結與討論

殘餌是水產養殖內源性污染的主要來源，由于養殖過程中餌料利用率最高不到70%，大量餌料不能被養殖動物攝食，并不斷在底泥中積累，這些有機物在分解過程中需消耗大量的溶解氧，產生硫化氫、氨氮等有害物質，嚴重污染水體，易導致疾病暴發，甚至養殖生物死亡。在蝦稻共作田中，春季投餌也導致水體溶氧驟降，氨氮和亞硝態氮等有機質含量增加等問題。水產養殖微生態制劑因其具有分解有機物、降低氨氮和亞硝氮濃度、抑制有害微生物的繁殖、改善養殖生態環境的作用，已被廣泛使用。本研究從長期蝦稻共作田中分離了6株有機質降解菌，并研究了菌株的生長特性、有機質降解特性和產酶能力。

從洪湖、后湖和咸寧等地長期蝦稻共作養殖環境（連續蝦稻共作12～20年）均分離到屬于阿氏芽孢桿菌的有機質降解菌，且這些菌株降解活性高，能夠產生多種胞外酶，這表明這類細菌可能在蝦稻共作田中具有更廣泛的適應能力。值得注意的是，從丫角4-3分離的黃海芽孢桿菌具有凝集聚團的特性，細菌在培養液中形成顆粒性沉淀，細菌的自凝集能力與細菌表面疏水性直接相關［12］。自凝集能力對細菌的生存有重要意義，通過自凝集達到一定的數量以形成生物被膜或黏附到宿主黏膜表面來發揮生物學功能［13］，底泥是養殖環境重要的內源性污染來源，若通過細菌自凝集直接作用于底泥污染物，可有效改善養殖環境，該菌株的應用價值還需要進一步研究。

本研究中分離的芽孢桿菌具有高效降解飼料浸出液有機質的能力，其中OD-1至OD-3培養1 d降解率即達70%以上，培養3～5 d后，OD-1至OD-5的降解率最終能達90%左右，高于從其他養殖環境中分離的有機質降解菌，如從羅非魚養殖系統中分離的有機質降解菌在培養3 d后對飼料浸出液中有機質的降解率為49%～53%［14］。從對蝦養殖池塘中篩選的有機質降解菌在培養5 d內對蝦餌料培養基的降解率為59%～79%［15］。這可能是由于本研究中有機質降解菌分離自長期蝦稻共作養殖環境（連續蝦稻共作時間12～20年），長期養殖使得底泥積累了豐富的有機質，從而富集大量有機質降解菌。本研究中有機質降解菌能利用飼料浸出液有機質進行快速生長［8］，大多在接種8 h后進入對數期，在12～16 h即進入穩定期，此外有機質降解能力與細菌的產胞外酶能力有關，OD-1、OD-2能夠產多種胞外酶，這或許能夠解釋其快速而高效的降解能力，而僅能產蛋白酶的OD-6，其降解速率則相對較低。

本研究篩選6株有機質降解菌，經鑒定均為芽孢桿菌，其中，OD-1、OD-2能夠快速而高效地降解餌料培養基中的有機質，這可能與其能夠分泌較多種類胞外酶能力有關，這2種菌株具有一定的應用潛力。