miRNAs調(diào)節(jié)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的研究

李華 肖萍萍 蘇俊男 賴 冬 林姝婷 黃金梅 田麗紅

（1 廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院科教部，福建 廈門 361021；2 廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院血液/風(fēng)濕免疫科，福建 廈門 361021；3 廈門醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院輸血科，福建 廈門 361021）

缺血性疾病是臨床常見病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命，長期缺血容易對血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）造成不可逆的傷害，導(dǎo)致血管供血不足，器官衰竭，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥[1]。缺血性腦血管病（如腦梗死）、缺血性心臟病（如心肌梗死）、缺血性下肢病變（如閉塞性血栓血管炎）在臨床上較為常見，嚴(yán)重危害人類健康。但藥物治療和血管搭橋治療嚴(yán)重缺血性血管疾病存在一定的局限性。組織工程血管移植是一種很有前景的缺血性疾病治療技術(shù)。血管再生是組織修復(fù)、組織移植和手術(shù)修復(fù)的關(guān)鍵因素之一。內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁形成的重要組成部分，也是是組織工程血管移植的重要材料，內(nèi)皮細(xì)胞的植入有助于形成復(fù)雜的、有功能的新生血管系統(tǒng)[2-3]。然而，內(nèi)皮細(xì)胞來源的不足，限制了內(nèi)皮細(xì)胞的臨床應(yīng)用[4]。人間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，MSCs）可以從多種組織中分離出來，如羊膜、絨毛膜、華通氏膠、羊水、臍帶血和骨髓等。MSCs具有多向分化和自我更新的特性，利用其分化為平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的能力，可以用作血管組織移植[2,4]。

MicroRNA（miRNA）是短鏈非編碼RNA，長度為20～25 nt，它通過抑制翻譯或破壞靶mRNA的穩(wěn)定來調(diào)節(jié)靶mRNA的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)多種重要的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞周期、造血、神經(jīng)發(fā)生、衰老、癌癥和心血管疾病[5]。有證據(jù)表明，miRNA是內(nèi)皮細(xì)胞功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，尤其是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子。Hu等[6]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-126可以抑制EVH1結(jié)構(gòu)域含蛋白1、磷酸肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基2和血管細(xì)胞黏附分子1三個(gè)靶基因來促進(jìn)小鼠的血管生成。Lou教授等研究發(fā)現(xiàn)，miR-122-5p通過靶向內(nèi)皮細(xì)胞中的AGPAT1增強(qiáng)脂肪酸的使用，促進(jìn)小鼠的微血管生成，顯示miR-122-5p在組織修復(fù)中的治療潛力[7]。VEGF也是miR調(diào)節(jié)的一個(gè)靶點(diǎn)，miR-146[8]和miR-126均可增強(qiáng)VEGF的促血管生成作用，促進(jìn)血管形成[9]。下調(diào)miR-26a-5p促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的管形成[10]。過表達(dá)miR-34a會(huì)通過靶向Notch通路增加vWF和CD31的表達(dá)，從而促進(jìn)腦腫瘤干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化[11]。下調(diào)microRNA-145可提高vWF和CD31的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)脂肪干細(xì)胞向微血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)血管生成[12]。是否臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮分化具有可行性，通過MicroRNA的調(diào)控來闡明其部分分化機(jī)制，有利于未來血管組織工程學(xué)的研究和臨床應(yīng)用。

因此，本研究旨在鑒定與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCMSCs）向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化相關(guān)的miRNA，從而闡明調(diào)控這一過程的miRNA分子。本研究從臍帶中分離出MSCs，并分化為內(nèi)皮細(xì)胞，檢測分化過程中vWF和CD31的水平以及分化前后miRNAs的變化。

1 材料與方法

1.1 MSCs的分離和培養(yǎng) 本項(xiàng)目經(jīng)廈門醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2016012），在知情同意的情況下，從健康的孕產(chǎn)婦捐贈(zèng)者處獲取臍帶。用含25 mg/L慶大霉素的生理鹽水清洗3次后，將臍帶剪成1 cm×1 cm的小塊，然后切除下方的血管周圍沃頓氏果凍組織。將切除的組織切成3 mm×3 mm的切片，置于10 cm的組織培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中含有5 mL無血清的MSCs培養(yǎng)液（Yocon，北京），置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。第3天加入5 mL培養(yǎng)基，第7天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)7～9 d后，當(dāng)細(xì)胞生長至融合傳代時(shí)，第13天用含1 mmol/L EDTA 2.5g/L胰蛋白酶消化，離心去上清，收集細(xì)胞，以8000個(gè)/cm2的密度接種到培養(yǎng)皿中。

1.2 MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化 采用EBMTM-2內(nèi)皮細(xì)胞生長基礎(chǔ)培養(yǎng)基-2（Lonza），第三代的MSCs以5×104/cm2的濃度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，用EGMTM-2 MV微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（Lonza）誘導(dǎo)分化。根據(jù)試劑盒說明誘導(dǎo)2～3周后，收集細(xì)胞并通過流式細(xì)胞儀鑒定。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞 收集細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗一次。流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)活細(xì)胞，制片1×106細(xì)胞，用100 μL PBS重懸。在細(xì)胞中加入熒光抗體（5 μL），在25 ℃下孵育10 min。PBS洗滌3次后，每個(gè)樣本用100 μL PBS重懸，使用NovoCyteTM流式細(xì)胞儀（ACEA，San Diego，CA，美國）分析。

1.4 RNA水平檢測 使用Trizol（Ambion，上海）從細(xì)胞中提取RNA，并使用Hiscript逆轉(zhuǎn)錄酶（VAZYME，南京，）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照Xu等[13]文獻(xiàn)描述。利用特異性引物完成miRNA的逆轉(zhuǎn)錄。然后采用SYBR Green Master Mix（VAZYME，南京，）對該cDNA進(jìn)行進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR（RT-PCR）檢測RNA水平，miRNA水平檢測采用相同的逆轉(zhuǎn)錄引物。

1.5 蛋白質(zhì)水平檢測 采用Western blot方法檢測CD31和vWF蛋白水平，使用冷的RIPA緩沖液（beyotime，上海）、PVDF膜（Millipore，上海）和抗體，根據(jù)Zheng等[14]文獻(xiàn)所述步驟進(jìn)行操作。

1.6 雙熒光素報(bào)告酶分析 獲得用于雙熒光素酶報(bào)告基因檢測的CD313'UTR和vWF 3'UTR質(zhì)粒，分別命名為CD313'UTR和vWF 3'UTR。采用HEK293細(xì)胞（IMMOCELL，廈門，）進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測，如Xu等[15]所述。將CD313'UTR與陰性對照miRNA mimic（miRNA-nc）或miR-26a-5p mimic共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中；vWF 3'UTR與陰性對照miRNA-NC或miR-15a-5p，miR-761，miR-335-5p and miR-16-5p mimic共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。并使用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，上海），根據(jù)試劑說明共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞。48 h后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)（Promega，北京）進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測。

1.7 成管實(shí)驗(yàn) 通過體外血管形成實(shí)驗(yàn)來檢測MSCs的血管生成潛能，如前所述[16]，將基質(zhì)（康寧）與培養(yǎng)基按等比例混合，以50 μL/孔的體積加到96孔板中。將分化9天的細(xì)胞收獲，以2×104細(xì)胞/孔的密度播種于96孔板中，孵育12 h。倒置顯微鏡下拍照觀察管的形成情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 兩組比較采用非配對樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。結(jié)果在P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS軟件（22.0版）。圖表和熱圖使用GraphPad Prism 8制作。

2 結(jié)果

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與鑒定 從新鮮人臍帶中分離的細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣，梭形形態(tài)，呈黏附生長（圖1A）。從第7代到第8代，增殖率顯著增加（圖1B）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，MSCs標(biāo)志物CD29、CD44、CD105表達(dá)，不表達(dá)HLA-G、HLA-DR、CD80、CD86、CD45、CD31、CD34、vWF（圖1C）。這些結(jié)果表明，間充質(zhì)干細(xì)胞被成功地分離和增殖。

圖1 間充質(zhì)干細(xì)胞的特征

2.2 MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的誘導(dǎo) 誘導(dǎo)分化后，MSCs呈短梭形，與未分化的MSCs明顯不同（圖2A）。誘導(dǎo)分化9天的細(xì)胞能夠形成獨(dú)立條索狀的血管樣結(jié)構(gòu)（圖2B）。在誘導(dǎo)期，細(xì)胞生長迅速。Western blot、RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測CD31和vWF的表達(dá)（圖3）。誘導(dǎo)第9天，約60%的培養(yǎng)細(xì)胞中觀察到CD31和vWF的表達(dá)（圖3A）。隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，CD31和vWF的表達(dá)逐漸誘導(dǎo)增加，而未分化的MSCs（第0天）在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過程中不表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志物（圖3B-3D），表明MSCs成功分化為內(nèi)皮細(xì)胞。

圖2 （A）不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)分化后MSCs的形態(tài)特征。（B）分化9 d后細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞被誘導(dǎo)形成血管。

圖3 （A）誘導(dǎo)9天后流式細(xì)胞術(shù)鑒定誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞。（B）RTPCR檢測內(nèi)皮特異性標(biāo)志物的表達(dá)。（C-D）western blot檢測內(nèi)皮特異性標(biāo)志物的表達(dá)。ns：無差異；*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001；****：P＜0.0001

2.3 靶向CD31和vWF的miRNA的預(yù)測和驗(yàn)證 使用TarBase、miRDB和mirDIP預(yù)測靶向CD31或vWF的miRNA。這三個(gè)數(shù)據(jù)庫只預(yù)測了1個(gè)靶向CD31的miRNA和9個(gè)靶向vWF的miRNA（圖4A，4B）。為了鑒定參與MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的miRNA，分別收集分化0、3、7和9天的MSCs。隨后檢測細(xì)胞中這些miRNA的水平，發(fā)現(xiàn)分化第9天，靶向CD31的miR-26a-5p水平顯著下降，靶向vWF的miR-24-3p、miR-15b-5p、miR-497-5p、miR-214-3p、miR-761、miR-335-5p和miR-16-5p水平顯著下降。而miR-15a-5p、miR-195-5p與誘導(dǎo)前無顯著差異（圖4C-4E）。基于以上結(jié)果，本研究選擇miR-26a-5p、miR-15a-5p、miR-761、miR-355-5p和miR-16-5p通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，miR-26a-5p靶向CD31的3'UTR，miR-761、miR-335-5p和miR-16-5p靶向vWF的3'UTR，而miR-15a-5p不靶向vWF的3'UTR（圖4F）。

圖4 預(yù)測和鑒定靶向CD31或vWF的miRNA。（A）預(yù)測靶向CD31的miRNA。（B）預(yù)測靶向vWF的miRNA。（C-E）不同分化時(shí)間點(diǎn)miRNA的表達(dá)。（F）雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證miRNAs靶向CD31或vWF的能力。ns：無差異；*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001；****：P＜0.0001

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中具有潛在的治療能力，特別是MSCs在體外誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能，體內(nèi)促進(jìn)血管生成。因此，MSCs作為一種有前景的治療方法將在缺血性疾病中被廣泛研究。心肌梗死、缺血性腦卒中和嚴(yán)重肢體缺血的動(dòng)物研究表明，人MSCs能促進(jìn)個(gè)體發(fā)生，加速組織再生。在MSC來源方面，臍帶與其他組織相比，具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：獲得比替代組織更安全，冷凍保存仍能保持細(xì)胞活力，傳播微生物和體細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)低，獲取該組織不存在道德和倫理問題。因此，臍帶是間充質(zhì)干細(xì)胞的重要來源。此外，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）已經(jīng)被證明可以誘導(dǎo)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化[15]。EGF和VEGF的結(jié)合可以誘導(dǎo)MSCs具有內(nèi)皮細(xì)胞的一些特征，內(nèi)皮細(xì)胞有助于新生血管的形成，通常表達(dá)特異性的表面生物標(biāo)志物，包括CD31、CD34、vWF、VE-Cadherin、血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2）。有研究報(bào)道，VEGF、bFGF、IGF、EGF同時(shí)刺激MSCs可更有效地誘導(dǎo)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化。在這項(xiàng)研究中，本研究利用上述刺激因子誘導(dǎo)臍帶來源的MSCs分化成內(nèi)皮細(xì)胞。但是間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞涉及多種基因和相互作用的信號通路的調(diào)節(jié)關(guān)系，MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的基因表達(dá)變化尚不完全清楚。通過探索mirRNA的調(diào)控機(jī)制，部分闡明相關(guān)調(diào)控機(jī)制，為臨床缺血性疾病的治療提供依據(jù)。

證據(jù)表明，miRNA在MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miRNA是一種包含17-25個(gè)核苷酸的單鏈小RNA，不編碼任何蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是生物過程的調(diào)節(jié)者。miRNA通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）結(jié)合，導(dǎo)致其降解或抑制其翻譯，從而調(diào)控基因表達(dá)。研究表明，miRNA靶向MSCs分化相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[17]。過表達(dá)miR-126通過激活PI3K/Akt和MAPK/ERK通路并釋放旁分泌因子促進(jìn)MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化[18]。本研究探索了參與MSCs分化內(nèi)皮細(xì)胞的miRNA。本研究篩選和驗(yàn)證的變化水平的miRNA針對CD31或vWF是內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)記。分化后發(fā)現(xiàn)，miR-26a-5p的水平，miR-24-3p，miR-15b-5p，mir-497-5-p，mir-214-3-p，mir-761，mir-335-5p，和miR-16-5p被降低了。有報(bào)道稱，下調(diào)miR-26a-5p可促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成，這與本研究類似。miR-15b/miR-16抑制血管生成[19]。miR-24靶向GATA4和PAK 2抑制血管生成[20]。據(jù)報(bào)道，miR-214可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮對血管生成刺激的反應(yīng)[21]；miR-335-5p與血管生成調(diào)控相關(guān)[22]。這些研究與本研究工作一致，本研究利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)也驗(yàn)證了其調(diào)控作用。然而，人臍帶來源的MSCs衍生的血管內(nèi)皮細(xì)胞在體內(nèi)形成血管的能力仍有待進(jìn)一步探索。這些miRNA調(diào)控MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

總之，本研究成功地分離和誘導(dǎo)了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)MSCs分化后，靶向CD31的miR-26a-5p和靶向vWF的miRNAs（包括miR-24-3p、miR-15b-5p、miR-497-5p、miR-214-3p、miR-761、miR-335-5p、miR-16-5p）水平下降，初步揭示了MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的分子機(jī)制，為體外血管形成的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。