生草對關中平原有機獼猴桃園土壤養分及細菌群落的影響

劉崇義， 靳旭妹， 王瑩瑩， 李騰飛， 陳新義， 曹馨悅， 龍明秀， 何樹斌

(西北農林科技大學草業與草原學院，陜西 楊凌 712100)

我國的獼猴桃產業的發展速度和規模令人矚目，種植面積接近世界總面積的72%，產量占全球總產量的55%[1]。但由于生產中大量施用化肥、農藥問題還很普遍，嚴重影響果品質量安全，制約了產品的國際市場占有率，不利于可持續發展。隨著人們生活質量和對食品安全意識的提高，有機獼猴桃生產則成為解決上述問題的必然選擇。但目前我國有機果園普遍存在土壤有機質含量較低、有機肥運輸成本高等問題。果園生草技術能改善果園土壤物理性狀，調節果園小氣候，提高土壤有機質含量、土壤養分和酶活性，還可以提高果品質量，對土壤肥力和果樹生長發育都有重要影響[2-4]，是有機果園安全生產的重要技術之一。

細菌在土壤養分轉化和循環等生物化學過程中發揮著重要作用[5]。土壤細菌在許多土壤化學過程中起著重要作用，參與有機質分解、碳氮循環、土壤團聚體和腐殖質的形成[6]。土壤細菌種群和群落組成受當地氣候、土壤類型、植物種類和土壤管理方式等一系列土壤因素的影響[7]。土壤細菌對外界干擾較為敏感，其群落組成、相對豐度等指標在一定程度上反映了作物對養分的吸收利用及其生長發育狀況[8]。生草覆蓋主要通過植物根系分泌物、生草凋落物降解以及土壤含水量改變來影響果園土壤細菌群落結構[9]。根系分泌物中含有大量有機質，包括氨基酸、糖類、有機酸、酚類、次生代謝物和蛋白質等，這些物質主要由植物根毛和根尖細胞分泌[10]。李磊等[11]研究表明，獼猴桃園套種蕺菜(Houttuyniacordata)可提高根際土壤細菌數量，有利于改善獼猴桃根際土壤環境。Nakamoto等[12]研究表明，種植白三葉草(Trifoliumrepens)顯著改善了土壤中細菌底物誘導的呼吸。因此，探討果園不同生草處理對果園土壤的影響具有重要意義[13]。

前人對于生草處理下有機獼猴桃園土壤細菌群落、土壤化學性質的研究尚少[8-9,14]。秣食豆可固氮，且地上生物量高、綠期長；草木樨根系較淺且固氮效果顯著；黑麥草能快速覆蓋地面，抑制雜草，總體生長表現和肥田效果均較好[14-15]。本研究通過對三種不同生草處理的有機獼猴桃園土壤養分及土壤細菌群落變化特征進行研究，以期為有機獼猴桃園的土壤管理提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與研究區概況

試驗地位于楊凌示范區五泉鎮上灣村陜西百恒有機果園有限公司(34° 30′ N，107°59′ E)，海拔418.0～540.1 m，年降水量635.1～663.9 mm，年均氣溫12.9℃。9齡徐香獼猴桃果園(株行距6 m×3.8 m)。試驗采用完全隨機區組設計，于2019年3月分別設置秣食豆(GM)、草木樨(MO)、一年生黑麥草(LP)、清耕(CK)4種處理，均采用條播，行距15 cm，播種量22.5 kg·hm-2；每個處理重復3次，共12個處理，小區面積為12 m×3.8 m=45.6 m2。2020年10月用土鉆采集0～20 cm土層土樣，按S形取樣法分別采集5鉆土壤，充分混合作為1個土樣，每個土樣分為2份：一份去除雜質后自然風干、研磨過篩，用于測定土壤化學性質和酶活性；另一份保存于-20℃冰箱及時送樣測序。

1.2 土壤化學性質測定

土壤樣品化學性質的測定方法參照《土壤微生物研究原理與方法》[16]。采用干燥恒重法(105℃)測定土壤水分含量；按1∶2.5的水土比混合后直接用pH計測定pH值；采用水合熱重鉻酸鉀氧化比色法測定土壤有機質(Soil organic carbon,SOM)；采用高效液相色譜法測定全氮(Total nitrogen,TN)凱氏蒸餾法；干燥恒重法(105℃)測定土壤水分；堿擴散法測定速效氮(Available nitrogen,AN)；氫氧化鈉熔融鉬銻反比色法測定總磷(Total phosphorus,TP)；堿熔土樣后，用Olsen法測定速效磷(Available phosphorus,AP)；用原子吸收分光光度法測定全鉀(Total potassium,TK)；用四苯硼酸鈉比濁法測定速效鉀(Available potassium,AK)。

1.3 土壤酶活性測定

本研究集中測定過氧化氫酶(Catalase,CAT)、β-葡萄糖苷酶(β-xylosidase,βG)、脲酶(Urease,URE)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)和蔗糖酶(Sucrase,SUC)5種酶活性，其中，土壤過氧化氫酶活性與土壤微生物活動相關，土壤蔗糖酶常用來表征土壤熟化程度和肥力水平，脲酶活性常被用來表征土壤氮素狀況[16]，β-葡萄糖苷酶主要參與土壤纖維素的降解，堿性磷酸酶能水解土壤磷循環中的重要底物磷酸多糖和磷酸酯[17]，土壤酶活性分析采用微孔板熒光法，具體測定步驟和酶活計算公式參照Marx[18]的研究內容。

1.4 土壤細菌相對豐度和多樣性測定

用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒提取細菌總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，紫外分光光度計對DNA進行定量。使用341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)引物來PCR擴增16S rDNA(V3+V4)可變區。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并對目標片段進行回收，回收采用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收試劑盒。使用AMPure XT beads (Beckman Coulter Genomics,USA)將PCR產物純化，Qubit (Invitrogen,USA)定量。分別使用Agilent 2100生物分析儀(Agilent,USA)和Illumina (Kapa Biosciences,USA)的文庫定量試劑盒評估擴增子文庫的大小和數量，在NovaSeq PE250平臺上對庫進行排序，使用QIIME2[19]的feature-classifier插件進行序列比對及物種注釋，比對數據庫為SILVA (https://www.arb-silva.de/)和NT-16S (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nt.gz)數據庫。數據已上傳NCBI數據庫(Bioproject:PRJNA734445)。測序工作由杭州聯川生物技術股份有限公司完成。

1.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2016對數據進行整理，采用IBM SPSS statistics 26軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗。使用QIIME2計算細菌β多樣性、使用PCoA分析不同生草處理土壤微生物群落結構差異。通過線性判別(LDA)效應法(LEfSe)分析不同生草處理之間具有顯著差異的物種。利用Canoco5.0軟件對土壤細菌群落和環境因子進行了RDA冗余分析。利用Graphpad prism 8和R(v3.6.1)ipraph軟件包繪制相關網絡圖和熱圖。使用R(v3.6.1)random forest包進行隨機森林分析。利用PICRUSt2軟件對不同牧草處理下土壤細菌的功能特性進行了預測，新推出的PICRUSt2預測軟件獲得的結果可以很好地匹配土壤細菌功能[20]。

2 結果與分析

2.1 不同生草處理對果園土壤養分及酶活性的影響

由表1可知，和CK相比，GM,MO,LP處理后土壤pH值顯著降低(P<0.05)，而SOM含量顯著升高(P<0.05)，其中三種生草處理SOM含量分別提高7.6%,11.4%,10.9%。GM與MO處理的TK含量顯著高于CK處理(P<0.05)，而AK含量顯著低于CK與LP處理(P<0.05)。GM處理的AP含量顯著高于其他3種處理(P<0.05)。不同處理的AN，TP，TN含量差異不顯著。獼猴桃果園生草處理的土壤βG，CAT，URE含量均有提升，其中GM和MO處理的CAT和URE含量相對CK處理顯著升高(P<0.05)，MO和LP處理的βG含量顯著升高。不同處理的ALP含量差異不顯著。

表1 不同生草處理樣地的土壤養分與酶活性

2.2 不同生草處理對果園土壤細菌群落組成結構影響分析

擴增細菌16S rDNA基因的V3-V4區后，通過高通量測序分析了群落的結構和組成。對于整個采樣集(12個土壤重復樣)，使用Illumina HiSeq分析鑒定出總共999 126個序列(原始標簽)，平均長度41.63 M。對原始下機數據進行雙端拼接、質量控制、嵌合體過濾后，獲得了949 508個高質量序列(純凈標簽)。最終，在所有樣品中共發現763 248個已處理序列(有效標簽)，占總定量序列的76.4%，測序量符合分析要求。如圖1所示，在所有樣本中主要的門是變形菌門(Proteobacteria)，平均占總序列的38.8%，其次分別為酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes)，分別占總序列的23.1%，9.6%和7.7%。

圖1 門水平物種組成柱狀堆疊圖

2.3 不同生草處理對果園土壤細菌多樣性分析

采用方差分析Anosim(Analysis of similarities)非參數檢驗比較各組細菌β多樣性的差異。不同分組因素對樣本差異的解釋度R值為0.299，分組顯著性P值為0.015，達到顯著水平，說明組間差異顯著大于組內差異，試驗設計分組合理可靠。通過比較不同生草處理間的距離發現(圖2b)，GM，MO和LP處理的β多樣性區別于CK處理。主坐標分析(Principal coordinate analysis,PCoA)(圖2a)可以很好地區分生草處理與清耕處理，不同處理之間的距離差異可以用PCoA兩軸解釋，PCoA1軸解釋度為32.7%，PCoA2軸解釋度為15.3%，說明生草處理改變了果園土壤細菌的群落結構。

圖2 不同處理細菌β多樣性分析

2.4 利用隨機森林算法對不同果園生草細菌群落結構重要菌屬分析

采用隨機森林算法(Random Forest)分析了不同生草處理下影響土壤細菌群落結構的重要細菌屬。該算法通過基尼(Gini)指數計算各變量對分類樹各節點觀測值異質性的影響，從而比較各變量的重要性。值越大，變量的重要性就越大。對GM,MO,LP,CK四種處理細菌組成通過隨機森林分析，找出區分不同處理間差異的關鍵成分得出了不同生草處理對土壤細菌群落多樣性的影響。不同生草處理間的差異代表種存在著明顯的差別，在門水平上(圖3a)，主要為厚壁菌門(Firmicutes)、匿桿菌門(Latescibacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)；在屬水平上，可鑒定的菌屬則以Stenotrophobacter屬、Bauldia屬、Kofleria屬為主。

圖3 門與屬水平土壤細菌群落隨機森林算法分析

2.5 對不同果園生草細菌群落結構的LEfSe差異分析

采用線性判別分析效應大小方法(LEfSe)對不同類群中的主要細菌進行了定量分析，進一步闡明了土壤樣品中鑒定出的細菌分支之間可能存在的相互作用。結果表明，不同土壤類群細菌豐度差異顯著(LDA>3.6，P<0.05)。在所有土壤樣品中共鑒定出65種特異菌群。在GM-CK的所有分類水平中，GM處理中篩選出11個特異菌群，CK處理中篩選出10個特異菌群(圖4)。GM組中，芽孢桿菌門的豐度較高(LDA=4.32，P=0.04)，主要為芽單胞菌科。浮霉菌門(LDA=4.14，P=0.04)和變形菌門(LDA=4.09，P=0.04)是MO-CK數據集中發現的特異菌群。LP-CK中的芽單胞菌門和變形菌門是主要差異菌群，LDA值分別為4.38和4.07。

圖4 各處理間土壤細菌群落組成的LEfSe分析(線性判別分析得分值大于3.6)

2.6 細菌群落結構與土壤養分的關聯性分析

在門水平上對土壤細菌群落結構與環境因子進行關聯性冗余分析(Redundancy analysis,RDA)，結果顯示第一主坐標軸解釋了58.2%的變異，第二主坐標軸解釋了17.1%的變異，前兩軸總共解釋了75.3%的變異(圖5a)，表明前兩軸能夠反映細菌門水平與土壤環境因子關系的絕大部分信息。將所測得的環境因子對土壤細菌物種多樣性的解釋度從大到小排列為:SUC>pH>CAT>AK>βG>TK>AP>SOM>URE。通過斯皮爾曼(Spearman)關聯系數計算表明(圖5b)，相比于其他土壤性質，河床菌門(Zixibacteria)豐度與土壤有機質、過氧化氫酶、脲酶、β-葡萄糖苷酶極顯著負相關(P<0.01)；藍藻細菌門(Cyanobacteria)豐度與有機質呈極顯著正相關，與速效鉀呈極顯著負相關(P<0.01)；芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)豐度與pH值呈極顯著負相關(P<0.01)；匿桿菌門(Latescibacteria)豐度與有機質、β-葡萄糖苷酶呈極顯著負相關(P<0.01)；厚壁菌門(Firmicutes)豐度與β-葡萄糖苷酶呈極顯著負相關(P<0.01)。

圖5 土壤細菌群落結構與環境因子的關聯性分析

2.7 PICRUSt2細菌群落功能預測分析

利用PICRUSt2軟件預測不同生草處理土壤細菌功能特征，將高通量測序結果得到的OTU豐度特征與京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)注釋基因數據庫比對，得到所有樣本在二級代謝通路共有39個(圖6)。注釋到膜轉運功能(Membrane transport)、能量代謝(Energy metabolism)和碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)的基因家族最多，所占百分比分別為12.2%，6.6%和6.3%。同時，研究也關注了三級代謝通路，注釋到分泌系統(Secretion system)、轉運(Transporters)、和雙組分調節系統(Two-component system)最多，所占百分比分別為5.8%，3.3%，3.0%，其中4組處理間泛醌和其他萜類醌的生物合成(Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis)、β-內酰胺抗性(Beta-Lactam resistance)、氯環己烷和氯苯降解(Chlorocyclohexane and chlorobenzene degradation)、RNA降解(RNA degradation)代謝通路存在顯著差異(P<0.05)，這些代謝特征反映了生草處理對土壤細菌群落功能的不同調控。

圖6 KEGG功能注釋及差異富集分析功能注釋及差異富集分析

3 討論

3.1 果園生草對土壤養分與酶活性的影響

在本研究中，相比于清耕處理，三種生草處理均顯著提高了土壤有機質含量，這與Qian等人研究結果一致[21]，其認為生草栽培能顯著提高果園表層土壤有機質含量。獼猴桃樹在土壤pH值為6.5～7.0的環境中生長良好[22]，本研究中生草處理的土壤pH值也得到了改善，該結果與王依等在秦嶺北麓獼猴桃園研究結果一致[23]。土壤酶類參與土壤中各種生化反應，主要影響有機物質分解、營養物質循環和能量轉移。本試驗中三種生草處理組土壤過氧化氫酶、脲酶含量均有提升，這與Zheng[24]、潘介春[25]、左玉環等[26]研究結果一致。而堿性磷酸酶差異并不顯著，草木樨處理的土壤蔗糖酶含量甚至低于清耕處理，說明生草處理對不同土壤酶活性的影響各不相同，需要長時間才能達到積極的效果[27]。

3.2 果園生草對土壤細菌多樣性的影響

土壤細菌是陸地生態系統的重要組成部分，在土壤養分轉化、循環等生化過程中發揮著重要作用。土壤細菌在許多土壤化學過程中起著重要作用，參與土壤碳氮循環、有機質分解、土壤團聚體和腐殖質形成。它們還與植物有各種共生和寄生關系[6]。果園生草使土壤細菌組成發生顯著變化，本研究中的三種生草處理與清耕處理的細菌組成存在顯著差異，果園生草能提高土壤細菌物種豐富度，在生草植被凋落物降解過程中，與植物有機質降解有關的土壤細菌數量增加，土壤細菌群落多樣性增加[28]。本研究中，土壤細菌主要為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，這和其他果園生草覆蓋的研究結果類似[29-31]。根據細菌的營養生活史來看，酸桿菌門(Acidobacteria)多屬于寡養菌(k-strategists)，主要分解難分解的碳。它們通常生長緩慢，主要生活在營養不良的環境中。而芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)是一種植物促生菌，通過與植物根系的相互作用，進行生物固氮，誘導植物分泌植物激素，促進植物生長，此菌門已從眾多植物中被分離出來[32-33]。

相較于清耕，秣食豆和黑麥草處理中纖維桿菌門豐度均有提高，在屬水平的豐度熱圖中，大部分細菌為現階段無法培養的菌屬，必須通過同源分析才可確定具體功能。β多樣性分析顯示，不同處理間組間差異顯著大于組內差異，生草處理β多樣性顯著高于清耕處理。通過隨機森林算法分析，我們發現不同處理間細菌差異的關鍵成分，其中厚壁菌門、匿桿菌門和浮霉菌門是生草組間差異代表物種，可以分別作為不同生草處理下的生物標記物，然而，其在群落中的豐富度并不是主要的，因此我們需要重新思考菌群豐度與其在環境中的重要性之間的關系[34]。厚壁菌門菌種能表達糖基水解酶，參與纖維素和半纖維素的降解[35]，因此生草覆蓋可以通過植被降解為厚壁菌門的生長提供碳源，這與前人的研究結果一致。

本研究中，細菌主要參與了膜轉運功能、能量代謝功能和碳水化合物代謝功能。相比于清耕處理，生草處理使植被多樣性升高，植被凋落物、殘體和根系分泌物發生改變[9]，從而導致細菌膜轉運和代謝功能出現差異，說明果園生草處理對土壤細菌功能基因產生顯著影響，對優化細菌群落結構有一定的作用。

4 結論

在關中平原有機獼猴桃園的三種生草處理均提高了土壤有機質和β-葡萄糖苷酶含量，改善了土壤pH值，草木樨與秣食豆處理提高了土壤全鉀、過氧化氫酶和脲酶含量。說明生草處理能夠提高有機獼猴桃園土壤養分，改良土質。生草處理同時改變了獼猴桃園土壤細菌群落之間的物種群落結構。同時，對細菌代謝通路的分析反映出土壤細菌對不同生草處理的響應與反饋機制存在差異。綜上，關中平原有機獼猴桃園種植草木樨、秣食豆和黑麥草可顯著提高土壤有機質和養分含量，改善土壤微生態環境，其中草木樨和秣食豆改良效果尤佳。