不同染色方法對兩種禾本科牧草菌根侵染率的影響

張海娟， 蘆光新*， 范月君， 周華坤， 周學麗， 竇聲云， 顏琿璘， 馬 坤， 趙陽安

(1.青海大學農牧學院， 青海 西寧 810016； 2.中國科學院西北高原生物研究所， 青海省寒區恢復生態學重點實驗室， 青海 西寧 810008； 3.青海省草原改良試驗站， 青海 共和 813000;4.青海農牧科技職業學院， 青海 湟源 812100)

叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizal，AM)真菌能與禾本科(Graminoids)、豆科(Leguminosae)、莎草科(Sedges)等植物互作形成菌絲(Hyphae)、泡囊(Vesicles)、孢子(spore)、叢枝(Arbuscular)等菌根結構[1]。菌根在調控植物株高和生物量[2-4]，促進植物根系發育和對氮磷等養分的吸收[5-8]，增強植物對低溫[9]、干旱[10]、鹽堿[11-12]及重金屬[13-14]等非生物脅迫的抵抗和耐受能力，以及改善土壤養分狀況及修復嚴重污染的土壤等方面發揮著重要的作用[15-16]。近年來，由于受到氣候變化和人類活動等干擾，大面積高寒草地出現不同程度退化，叢枝菌根真菌也被逐漸用于退化高寒草地恢復治理中，而適宜的草種和菌種是退化高寒草地植被和土壤得以恢復的必要物質基礎[17]。禾本科牧草如‘川草2號’老芒麥(Elymussibiricus‘Chuancao No.2’)和‘阿壩’垂穗披堿草(Elymusnutans‘Aba’)等因具有抗寒、耐貧瘠等特點，是高寒地區人工草地建植、天然草地補播改良和退化草地恢復治理中重要的牧草資源[18-20]。

菌根侵染率表示植物受AM真菌侵染的程度，其檢測值會受染色效果的影響[21]，檢測菌根侵染率常用的染色方法有酸性品紅、臺盼藍和墨水醋染色法。不同研究者因植物種類等不同而采用了不同的染色方法，其菌根觀測效果亦有所差異。房鳳如[22]、景躍波等[23]和晏梅靜等[24]用臺盼藍分別染色楊樹(Populus)、杉木林(Cunninghamialanceolata)和桑樹(Morusalba)根部的AM真菌后，能觀察到孢子、菌絲和泡囊等結構；毛圓圓[25]、蔡柏巖等[26]、邵金誠等[27]和李文彬等[28]用酸性品紅分別染色香根草(Vetiveriazizanioides)，黃檗(Phellodendronamurense)，甘蔗(Saccharumofficinarum)和高羊茅(Festucaarundinacea)根系AM真菌后，也能清晰觀察到菌絲、孢子和泡囊結構；汪茜等[29]和廖楠等[30]用墨水醋染色生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)和甘蔗根系AM真菌后，亦能清楚觀察到菌絲、泡囊和孢子結構。

目前，對禾本科牧草接種AM真菌檢測菌根侵染效應的研究已有很多，涉及的禾本科牧草有早熟禾(Poapratensis)[31-32]、黑麥草(Loliumperenne)[33-36]、狗牙根(Cynodondactylon)[37]、狼尾草(Setariaviridis)[38]、羊草(Leymuschinensis)[39]、冷蒿(Artemisiafrigida)[40]、高羊茅(Festucaarundinacea)[12]等，但未見對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草接種AM真菌的研究。為此，本研究通過對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草接種根內球囊霉(Glomusintraradices，GI)和摩西球囊霉(Glomusmosseae，GM)，探討2種禾本科牧草與AM真菌的共生情況，同時探討了酸性品紅、臺盼藍和墨水醋3種染色方法對菌根侵染率的影響，以期為禾本科牧草菌根侵染率的測定提供技術指導，同時也為“植被-微生物”聯合生態修復技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1禾本科牧草 試驗材料為環青海湖地區引種的‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草，購自四川省草原科學研究院。播種前，供試牧草種子均用10%H2O2消毒10 min，無菌水清洗干凈后用濾紙吸干水分備用。

1.1.2供試菌劑 供試AM真菌為由長江大學吳楚教授饋贈的根內球囊霉和摩西球囊霉，均為包含根段、叢枝、菌絲和孢子等的混合物。

1.1.3培養基質 培養基質為青海大學農牧試驗田壤土和河沙(3∶1)的混合物，養分含量見表1，經高壓蒸汽滅菌后使用(121℃，2 h)。

表1 試驗田土壤養分含量

1.1.4培養盆缽 培養盆缽為規格18 cm × 15 cm × 13 cm(上口徑×下口徑×高)的塑料花盆，使用前用75%酒精反復擦拭消毒。

1.1.5染色劑 酸性品紅：0.15 g酸性品紅+ 100 mL乳酸+ 100 mL甘油+ 100 mL蒸餾水；臺盼藍：0.05 g臺盼藍+ 100 mL乳酸+ 100 mL甘油+ 100 mL蒸餾水；墨水醋：5 mL Quink牌純黑墨水+ 95 mL家用白醋。

1.2 試驗設計

試驗設置接種根內球囊霉(GI)、接種摩西球囊霉(GM)和不接種(Control check，CK)3個處理，每個處理4次重復，每種牧草有12盆，共有24盆，隨機排列，隔天依次調換花盆位置，確保各盆所處的培養條件一致。稱取400 g滅菌基質裝于經消毒處理的塑料花盆中，噴灑適量無菌水，準確稱取10 g供試AM真菌菌劑均勻的鋪撒于上面，覆蓋60 g滅菌基質，每盆澆100 mL無菌水，然后以30粒每盆的播種密度分別播種2種禾本科牧草種子，覆土40 g后再次噴少量無菌水，出苗7 d后間苗并定苗至20株每盆。盆栽試驗在青海大學農牧實驗樓草地微生物實驗室進行，栽培周期為2個月(2021年1月13日至2021年3月13日)。試驗期間，自然采光，白天溫度為(25±2)℃，夜間(19±2)℃。

1.3 測定指標

1.3.1孢子密度 栽培2個月后，每個處理隨機稱取20 g風干后混勻的根際土，采用濕篩傾析-蔗糖離心法式和光學顯微鏡下觀察孢子形態并用直接計數法計數

1.3.2菌根侵染率 取1 g宿主植物的新鮮根樣，抖落根際土后輕輕地用水漂洗干凈，剪成1 cm左右的根段，置于甲醛-乙酸-乙醇固定液(Formaldehyde acetic acid，FAA)中固定過夜，次日取出適量根系洗凈后分別用臺盼藍、酸性品紅和墨水醋染色法進行染色[27]。染色完成后隨機選取10條根段，完成制片，3次重復。做好的壓片通過光學顯微鏡觀察孢子、菌絲、泡囊等菌根結構，染色質量較好的壓片在熒光顯微鏡下拍照，然后按Biermann等的方法計算菌根侵染率[41]。

1.4 數據分析

用Excel軟件整理數據，用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 孢子密度

通過濕篩傾析-蔗糖離心法分離獲得的孢子在體式和光學顯微鏡下的形態如圖1所示。可以看出，兩種AM真菌孢子形態多為不規則球形，淺黃至黃褐色。直接觀測計數后分析發現，不接種的對照處理均無孢子出現(圖1a，1 d)，而接種的處理均能分離出孢子(圖1b，1c，1e，1f)?！ú?號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草分別接種根內球囊霉和摩西球囊霉2個月后，‘川草2號’老芒麥根際孢子密度分別為119個·(20 g)-1和145個·(20 g)-1，‘阿壩’垂穗披堿草根際孢子密度分別為63個·(20 g)-1和74個·(20 g)-1，且‘川草2號’老芒麥接種處理的孢子密度顯著高于‘阿壩’垂穗披堿草(P<0.05)(表2)。

圖1 2種AM真菌接種處理下2種禾本科牧草根際孢子顯微形態

表2 接種對2種禾本科牧草根際孢子密度的影響

2.2 不同染色方法對菌根侵染率的影響

2.2.1臺盼藍染色的菌根結構觀測效果 由圖2可知，用臺盼藍染色法對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的根內球囊霉和摩西球囊霉進行水浴加熱染色后，除了對照外，均能清晰的觀察到根皮層AM真菌的泡囊、孢子和菌絲結構，說明臺盼藍染色劑利于泡囊等菌根結構著色，利于菌根結構的觀察?？梢钥闯?，未接種AM真菌的處理無菌根侵染的跡象(圖2A，2D)，而接種的處理則被不同程度侵染(圖2B，2C，2E，2F)。

圖2 臺盼藍染色劑對2種禾本科牧草根系2種AM真菌的染色效果

2.2.2酸性品紅染色的菌根結構觀測效果 用酸性品紅對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的根內球囊霉和摩西球囊霉染色后發現，除了不接種的對照處理外(圖3A，3D)，在光學顯微鏡下均能較為清晰的觀察到泡囊、菌絲等菌根結構(圖3B，3C，3E，3F)，但其效果略次于臺盼藍染色劑染色的效果。因此，在實際研究中，可根據試劑的存儲情況等進行選擇。2種染色劑也可以交叉使用，視覺效果會更佳。

圖3 酸性品紅染色劑對2種禾本科牧草根系2種AM真菌的染色效果

2.2.3墨水醋染色的菌根結構觀測效果 使用5%的墨水醋染色劑對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的根內球囊霉和摩西球囊霉染色后發現，在光學顯微鏡下很難觀察到菌根結構(圖4)，隨后進行的多次染色試驗效果亦是如此。可見，墨水醋染色法對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草根系的根內球囊霉和摩西球囊霉的染色效果差，會影響菌根侵染率的測定，實際研究中應慎選。

圖4 墨水醋染色劑對2種禾本科牧草根系2種AM真菌的染色效果

2.2.4不同染色方法對菌根侵染率的影響 3種染色方法對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草菌根侵染率的影響存在差異(表3)。用臺盼藍染色后，根內球囊霉對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率分別為66.3%和55.3%，摩西球囊霉對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率分別為71.3%和73.3%；用酸性品紅染色后，根內球囊霉對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率分別為63.0%和49.1%，摩西球囊霉對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率分別為65.3%和63.0%；而用墨水醋染色的菌根侵染率均為0。經分析，根內球囊霉和摩西球囊霉對‘川草2號’老芒麥的菌根侵染率之間差異不顯著，對‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率之間差異顯著(P<0.05)；臺盼藍和酸性品紅染色法對2種禾本科牧草菌根侵染率的影響差異均不顯著，與墨水醋染色的菌根侵染率之間差異顯著(P<0.05)。

表3 3種染色方法對2種禾本科牧草菌根侵染率的影響

3 討論

3.1 不同AM真菌對不同植物的接種效應

本研究結果顯示根內球囊霉和摩西球囊霉對‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的菌根侵染率存在差異，這可能是由這2種禾本科牧草對菌根的依賴性不同所致，也可能是因為2種牧草根部產生的分泌物對2種AM真菌的刺激程度不一樣引起的。許多相關研究與本研究結果一致，如肖雪毅等對黑麥草(Loliumperenne)分別接種3種不同的AM真菌后侵染率分別為2%，14%和3%[35]；楊婷等對紫花苜蓿(Medicagosativa)和黑麥草分別接種蘇格蘭球囊霉(Glomuscaledonium)后紫花苜蓿菌根侵染率大于黑麥草[36]；王麗萍等測得摩西球囊霉對黑麥草的菌根侵染率在33.33%～66.67%之間[15]；馮海艷等用摩西球囊霉和根內球囊霉分別接種黑麥草后測得菌根侵染率分別為34%和38%[42]。這些研究結果都表明，不同AM真菌對黑麥草的侵染率存在差異。馬放等用摩西球囊霉和根內球囊霉分別接種早熟禾(Poapratensis)后，測得菌根侵染率分別為49.49%和41.81%[31]；楊海霞等用2種不同的AM真菌分別接種高羊茅(Festucaarundinacea)和草地早熟禾發后發現菌根侵染率草地早熟禾>高羊茅，分別為17.0%，19.5%和57.7%，39.4%[12]；王立等對早熟禾分別接種了根內球囊霉和摩西球囊霉后發現摩西球囊霉的菌根侵染率高于根內球囊霉，分別為35.71%和43.27%[32]?？梢?，早熟禾的菌根侵染率也因AM真菌類型不同而呈現差異。對其他植物的菌根侵染率亦是如此，如賈振宇等對羊草(Leymuschinensis)分別接種摩西球囊霉和地表多抱囊霉(Diveversiforme)后測得菌根侵染率分別為17%和56%[10]；葉少萍等對狗牙根(Cynodondactylon)接種摩西球囊霉和聚叢球囊霉(Glomusaggregatum)后菌根侵染率為49.50%和58.01%[37]；寧楚涵等對蘆葦(Phragmitescommunis)和狼尾草(Pennisetumalopecuroides)接種摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)和根內根孢囊霉(Rhizophagusintraradices)后測得菌根侵染率分別為55.3%，52.7%和46.4%，44.6%[38]。以上研究結果表明，不同AM真菌對同種或不同植物的菌根侵染率存在差異。

3.2 不同染色方法對不同植物根系AM真菌的染色效果

通過對比臺盼藍、酸性品紅和墨水醋染色的效果發現，臺盼藍和酸性品紅染色的效果明顯優于墨水醋染色的效果。用前2種染色方法染色，AM真菌的孢子、菌絲和泡囊著色效果很好，便于觀察菌根結構和測定侵染率。這一方面可能跟植物的根系結構相關，如根的堅韌程度。栽培2個月的‘川草2號’老芒麥和‘阿壩’垂穗披堿草的根系較為細嫩，用10%KOH溶液透明處理1 h后，牧草根部皮層細胞中的細胞質基本清除干凈，極大的方便了染色劑的滲透[21]，因此孢子等更容易著色。其他研究者也做了相關研究，如婁璇[43]采用臺盼藍對水稻根系AM真菌染色后，能清晰觀察到根內菌絲和泡囊以及根細胞內形成的叢枝結構；而劉曉迪等[44]同樣采用臺盼藍對番茄(Solanumlycopersicum)根段染色后菌根觀測效果卻一般；蔡柏巖等[26]采用酸性品紅對黃檗根圍AM真菌染色后菌根觀測效果不佳。另一方面可能跟水浴加熱透明和染色的時間有關。本研究對供試材料在處理時間上控制到位，因此觀測效果較好。房鳳如[22]采用臺盼藍對楊樹根部AM真菌進行了過夜染色，結果能清晰觀察到孢子、菌絲和泡囊等結構。毛圓圓[25]對香根草根系AM真菌用酸性品紅染色后靜置過夜，次日在香根草根系中可以觀察到AM真菌的侵入點、菌絲、泡囊和叢枝等結構?？梢?，染色時間也是影響染色效果的關鍵因素之一，把控好染色時間可以改善觀測效果。

用墨水醋染色后，本研究很難觀察到任何菌根結構。然而，汪茜等[29]，廖楠等[30]同樣采用了墨水醋染色法，卻能清楚觀察到生姜和甘蔗根系AM真菌的菌絲等菌根結構。這可能是因為墨水醋染色法適用于生姜、甘蔗等根系相對堅韌的植物根系的AM真菌的染色，而本研究所選的宿主植物根系幼嫩，因而導致孢子、泡囊等著色困難，進而影響了染色質量；也有可能是染色時間或者墨水質量的問題。

4 結論

不同染色方法對2種禾本科牧草根系AM真菌的染色效果不一致，用臺盼藍染色法染色后發現，孢子、菌絲和泡囊等菌根結構更易于著色。因此，為了保證菌根觀測效果和菌根侵染率測定結果的準確性，在研究不同植物菌根侵染率時，應根據菌根著色效果選擇最佳的染色方法。