根瘤菌對紫花苜蓿生物修復鎘污染功能的影響

孔海明， 李開源， 高雙紅， 孫孌姿

(西北農林科技大學草業與草原學院， 陜西 楊凌 712100)

隨著我國工業的飛速發展，土壤重金屬污染已成為破壞生態環境、阻礙農業發展的重要問題[1]。其中，鎘(Cadmium，Cd)的污染問題最為突出，Cd污染土壤面積已達到2×105km2，約占總耕地面積的1/6[2]。土壤中的Cd可通過食物鏈的富集作用進入人和動物體內，嚴重危害人和動物的健康。因此，Cd污染土壤的修復治理問題亟待解決[3]。治理重金屬污染土壤的傳統方法有物理法和化學法，不僅成本高，還易造成二次污染。植物修復作為近年來興起的新型修復重金屬污染土壤的方法，成本低且保護土壤生態環境，被廣泛認可和接受[4]。植物修復是利用植物根部吸收污染土壤中的重金屬，并使重金屬在植物地上部分積累，收割植物地上部分，即可在不破壞土壤結構的基礎上去除污染物[1]。其中，氮素作為植物生長必需的營養元素，可提高植物對重金屬污染土壤的修復功能。研究表明，利用非固氮植物修復Cd污染土壤時，施加氮肥可改變土壤中Cd的有效性及其在植物中的富集量，進而提高植物對Cd的生物修復能力[5]。但是，施用氮肥不僅增加成本，過多施氮還可能產生二次污染[6]。

根瘤菌是豆科植物重要的共生微生物，在土壤氮素不足的條件下，根瘤菌可將空氣中的分子態氮轉化為植物可直接利用的氮素[7]，為植物提供氮素營養。根瘤菌共生對促進植物生長、提高作物產量具有重要作用[8]，并且可以減少人工施氮量從而保護土壤生態環境。已有研究表明，接種根瘤菌可增強豆科植物生物修復重金屬污染土壤的功能[9]，根瘤菌可以直接螯合、沉淀、轉化、吸附和積累重金屬，還可通過固氮、磷溶解、植物激素合成等促進豆科植物生長，同時降低Cd毒性[10]。其中，Younis等[11]發現接種根瘤菌可提高扁豆(LablabpurpureusSweet)對Cd的抗性，促進生長。Chen等[12]表明接種根瘤菌的含羞草(Mimosapudica)對Cd的吸收能力可提高70%。但是，在Cd脅迫下，根瘤菌是否可以通過改變植物的氮素營養而影響其對Cd的生物修復功能尚不清楚。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是豆科多年生草本植物，抗逆性強、根系發達、生物量大，且耐頻繁刈割，可起到保護水土、改良土壤的作用，具有較好的生態價值，是目前生態修復研究的重要植物[13-14]。本試驗以紫花苜蓿為研究對象，在不同氮素水平上對其進行接種和不接種根瘤菌處理，研究根瘤菌對紫花苜蓿生長和鎘吸收的影響，為Cd污染土壤中修復植物的選擇以及修復技術的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料培養

試驗于2020年7月25日在西北農林科技大學草業與草原學院進行，供試紫花苜蓿為‘三得利’品種，供試菌株是苜蓿中華根瘤菌Rm1021。

挑選籽粒飽滿且大小均一的種子，用15% H2O2浸種消毒10 min后，用蒸餾水沖洗4～5次，置于鋪有兩層滅菌濾紙的培養皿中，于25℃光照的人工氣候培養間中萌發，待長出真葉后移至裝有石英砂的圓形塑料花盆中(口徑12 cm，高23 cm)，每盆3株植物。移栽后，置于溫度25℃、光照時長15 h的培養間內。每天澆灌1/2 Hoagland’s營養液。

1.2 試驗材料處理

為探究氮素水平對紫花苜蓿生物修復的影響，待植株生長至30 cm時，將植株隨機分成兩組進行氮素處理。由于根瘤菌在土壤氮素含量低于4.5 mmol·L-1下可接種成功[15]，因此設置低氮(1 mmol·L-1)和高氮(4 mmol·L-1)兩個水平，隨后在每個氮素水平上進行根瘤菌接種和不接種處理。為促使紫花苜蓿接種成功，接種后，將全部植株統一剪至7 cm高。接種后一周將根挖出查看，在確保根系著生粉紅色有效根瘤后，施加Cd脅迫處理(CdCl2)。研究共設置4個Cd水平：0 mmol·L-1(CK)，0.25 mmol·L-1，0.5 mmol·L-1，1.0 mmol·L-1。因此，本研究共計16個處理(2個氮素水平N×2個接種處理R×4個Cd處理)，每個處理4次重復，共64盆植物。為防止蒸發造成土壤Cd及氮素的積累，每日的澆灌量達到澆透程度。30天后將整株植物采樣，用于各項指標的測定。

1.3 試驗指標和測定方法

株高和生物量的測定：用直尺測量株高。取紫花苜蓿鮮樣，用剪刀分離地上部和地下部，在烘箱內105℃殺青30 min后，在75℃烘干至恒重，于萬分之一天平上稱重，記錄干重。

Cd含量的測定：將植物樣品取樣烘干后，粉碎過0.425 mm篩。稱取樣品2.0 g放入消解管中，分別添加20 mL濃硝酸和4 mL高氯酸，然后低溫熱消解。當溶液到5 mL左右時加10 mL超純水，繼續消解15 min左右，轉移至25 mL容量瓶中，冷卻至室溫，以0.2%的硝酸定容，通過火焰原子吸收分光光度法測定其重金屬含量[16]。

氮含量的測定：將地上部和地下部植物樣品烘干后，磨碎過孔徑為0.074 mm篩，用凱氏定氮法測定紫花苜蓿含氮量。

葉片丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量的測定：采用硫代巴比妥酸法[17]。以0.5% TBA溶液為空白對照，測定450 nm，532 nm和600 nm處的吸光值，用公式MDA(μmol·g-1FW)=[6.452×(A532—A600)—0.559×A450]×Vt/(Vs×FW)計算。其中，Vs為測定所用提取液體積(mL)，Vt為提取液總體積(mL)，下同。

葉綠素含量的測定：采用95%乙醇提取葉綠素[18]。后用紫外可見分光光度計(UV-6100S型，MAPADA，中國)在波長665 nm，649 nm下測定吸光度，利用公式葉綠素含量(mg·g-1FW)=(18.16A649+6.63A665)×Vt×n/(1 000×FW)計算單位鮮重(Fresh weight，FW)的總葉綠素含量，式中，n為稀釋倍數。

1.4 數據分析

利用SPSS 21.0對數據進行統計分析。當出現顯著交互作用時，使用Duncan’s法對每個Cd水平下數據進行差異顯著性檢驗(P<0.05)，試驗數據均用平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿株高和生物量

株高和生物量可反映植物的生長狀況。Cd脅迫可顯著降低紫花苜蓿的株高和生物量(表1)。在不同Cd脅迫下，增加施氮處理紫花苜蓿的株高和生物量均有所增加，說明添加氮素可緩解Cd對植物生長的毒害(表2，表3)。在2個氮素水平下，相比于未接種組，接種處理紫花苜蓿的株高和生物量均有所提高，Cd水平為0時，接種處理使低氮和高氮下植物株高分別增加10.20%和13.32%(P<0.05)，地上生物量分別增加34.62%和25.00%(P<0.05)。Cd水平為1.0 mmol·L-1時，接種處理對株高無顯著影響，但可顯著提高植物的地上和地下部生物量(P<0.05)(表3)。

表1 鎘水平、氮素水平和根瘤菌接種對苜蓿各指標影響的三因素方差分析

表2 不同處理下紫花苜蓿的株高

表3 不同處理下紫花苜蓿的生物量

2.2 紫花苜蓿Cd含量

植物體內Cd含量隨Cd水平的增加而顯著增加(表1)。無論接種與否，提高氮素水平可顯著增加地下部和地上部Cd的積累(P<0.05)(表4)。在2種氮素水平下，接種可一定程度上增加地上部和地下部的Cd含量。低氮條件下，相比于未接種處理，接種處理顯著提高紫花苜蓿地下部Cd的含量(P<0.05)(表4)；在3個Cd脅迫水平上，地上部Cd的含量分別增加24.40%，11.57%和11.96%。在高氮下，接種處理使3個Cd水平下植物地上部Cd含量顯著增加(P<0.05)(表4)，使地下部Cd含量分別增加37.78%，4.17%，20.97%。

表4 不同處理下紫花苜蓿的Cd含量

2.3 紫花苜蓿氮含量

植物地上部和地下部氮含量隨Cd脅迫水平的增加而顯著降低(P<0.05)(表1，表5)。在不同水平的Cd脅迫下，提高氮素水平可顯著增加植物地上部氮含量(P<0.05)(表1)，在Cd水平為1.0 mmol·L-1時，增施氮素可使接種組和未接種組紫花苜蓿地下部氮含量分別提高16.42%和54.55%(表5)。在2個氮素水平下，接種處理均可提高植物的氮素含量，接種組的地上和地下部的氮含量均高于未接種處理組(表5)。

表5 不同處理下紫花苜蓿的氮含量

2.4 紫花苜蓿MDA含量

MDA含量反映了膜脂過氧化的程度，可間接反映植物受Cd脅迫毒害的程度。由表1可知，MDA含量隨Cd脅迫水平的提高而顯著上升(P<0.05)。提高氮素水平顯著降低了MDA的含量(P<0.05)(表6)。鎘脅迫下，與不接種處理相比，接種處理進一步降低了MDA含量(P<0.05)(表6)。在0.25 mmol·L-1，0.5 mmol·L-1，1.0 mmol·L-1Cd水平下，接種根瘤菌使高氮下葉片MDA含量分別降低47.40%，37.91%，25.87%，低氮下分別降低38.30%，29.37%，28.42%。

表6 不同處理下紫花苜蓿中MDA含量

2.5 紫花苜蓿葉綠素含量

葉綠素作為光合作用的關鍵色素，其含量多少標志著植物生長能力的強弱，Cd脅迫可導致葉綠素分解，使葉片干枯發黃。由表7可知，葉綠素含量隨Cd脅迫水平的提高而下降。提高氮素水平可在一定程度上增加葉綠素含量。在高氮處理下，Cd水平為0.25 mmol·L-1時，與不接種處理相比，接種處理可使葉綠素含量增加27.11%(P<0.05)。

表7 不同處理下紫花苜蓿中總葉綠素含量

3 討論

Cd是重金屬污染土壤中的主要毒性元素之一，可被植物根系吸收并積累在莖葉中，進而隨著食物鏈危害人類健康[19]。在改良重金屬污染土壤中，生物修復是一種經濟、環保的方法。與非固氮植物相似，氮素也可增加紫花苜蓿對Cd的吸收，并增強紫花苜蓿對Cd的抗性。根瘤菌具有固氮功能[8]，并可增加根系對土壤氮素的吸收量[6]，從而提高植物的氮素含量。因此在Cd脅迫下，接種根瘤菌可增加紫花苜蓿的Cd含量以及葉綠素含量，降低MDA含量，從而提高紫花苜蓿對Cd污染的生物修復功能。

根系是植物與Cd最先接觸的部位，也是最先受到Cd毒害的部位[20]，Cd毒可使根系變短變粗、側根減少、活力降低，從而影響植物對Cd的吸收[21]。與前人研究一致，提高氮素水平顯著地提高了Cd脅迫下紫花苜蓿根系的重量。而接種根瘤菌也可提高紫花苜蓿的地下生物量[22]，增加根系表面積、根系體積和促進側根生長[6]，從而增加根系與土壤的接觸面積。另外，根瘤菌的細胞壁富含羧基陰離子和羧酸陰離子，易結合環境中的活性金屬陽離子到其表面[1]，進一步促進植物根系對Cd的吸附。

除了根系對土壤中Cd的吸收之外，Cd在植物地上部的積累也是決定植物生物修復功能的重要指標。相比于低氮條件，高氮下紫花苜蓿體內積累的Cd含量較高，說明氮素可增強紫花苜蓿對Cd的積累。施氮還能提高油菜(BrassicacampestrisL.)中Cd向地上部轉運積累的能力[23]，類似結論在山楊幼苗(PopulusdavidianaDode)[24]和白三葉(Trifoliumrepens)[4]的研究中也可得到。接種根瘤菌可顯著提高植物氮素含量，因此，根瘤菌可通過增加氮素含量，增加Cd在莖葉中的富集，從而提高植物對重金屬污染土壤的修復。

葉綠素含量可表征逆境脅迫下植物的衰老狀況。Cd脅迫可通過抑制5-氨基酮戊酸合成及抑制原葉綠素還原酶活性使植物葉綠素合成受阻[25]，降低光合速率，抑制植物生長。氮素是葉綠素合成的重要營養元素，提高氮素營養可增加Cd脅迫下葉綠素含量[24-26]。而根瘤菌可通過固氮作用提高紫花苜蓿氮素含量，進而提高Cd脅迫下葉綠素的含量，王鵬輝等[27]也表明，接種根瘤菌處理使各品種大豆(Glycinemax)的葉綠素含量比未接種根瘤菌處理高7.63%～39.06%。

MDA含量是衡量膜脂過氧化程度的重要指標。Cd脅迫誘導活性氧類物質的積累，導致膜脂過氧化[28]，從而增加MDA含量(表6)。提高氮素營養可減少MDA含量，說明氮素能夠提高植物對Cd的耐受性[29]，Hassan等[30]對水稻(OryzasativaL.)的研究結果也表明，Cd脅迫下，氮素可通過增加含氮化合物來穩定大分子、維持體內活性氧平衡以及抵抗細胞中氧化還原電位變化，從而減少MDA積累。而接種根瘤菌后可提高紫花苜蓿的氮素含量，緩解Cd脅迫對紫花苜蓿的細胞膜損傷，促進植物在逆境下的生長發育，從而發揮其改良土壤的生物修復功能。

4 結論

在Cd脅迫下，紫花苜蓿的株高下降，生物量減少，植物的生長發育受到抑制。提高氮素含量可促進葉綠素合成、降低MDA含量，并且增加植物對Cd的吸收。Cd脅迫下接種根瘤菌可增加植物體內氮素含量，增強植物對Cd的抗性。因此，根瘤菌可增強紫花苜蓿對鎘污染土壤的生物修復功能，在生物修復領域具有良好的應用潛力和前景。