煙酰胺腺嘌呤二核苷酸對(duì)急性脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

楊玉山，郭洪録，熊 健

脊髓缺血再灌注損傷(SCII)是脊髓組織缺血后恢復(fù)血流灌注時(shí)，引起的細(xì)胞代謝障礙和組織結(jié)構(gòu)破壞。缺血再灌注損傷可引起脊髓缺血相關(guān)的復(fù)雜代謝紊亂，從而導(dǎo)致神經(jīng)元變性和壞死[1]。脊髓神經(jīng)損傷或功能障礙可導(dǎo)致許多嚴(yán)重并發(fā)癥[2]。尋找一種有效的治療方法來改善SCII導(dǎo)致的神經(jīng)損傷是非常重要的。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是機(jī)體能量代謝的關(guān)鍵輔因子，也是多種酶的底物[3]。研究[4]表明，腦缺血再灌注會(huì)引起聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)的過度激活，從而導(dǎo)致大腦中NAD+水平的降低。此外，NAD+的補(bǔ)充可預(yù)防大腦中星形細(xì)胞死亡[5]。由于大腦和脊髓對(duì)缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)有一些相似之處[6]，因此筆者假設(shè)NAD+對(duì)SCII可能有神經(jīng)保護(hù)作用，并加以研究探討其內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24只10周SD雌性大鼠，體重為210～230 g，購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，清潔級(jí)。按隨機(jī)數(shù)字表法分成3組，每組8只，分別為A組(不夾閉主動(dòng)脈)、B組(主動(dòng)脈夾閉后注射生理鹽水)和C組(主動(dòng)脈夾閉后注射 NAD+)。大鼠的飼養(yǎng)操作嚴(yán)格按照長(zhǎng)江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)定進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物飼養(yǎng)于有溫度控制的環(huán)境中，并有照明和黑燈的循環(huán)，動(dòng)物均自由進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前做適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。所有程序經(jīng)長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 手術(shù)方法根據(jù)文獻(xiàn)[7]的描述制備SCII動(dòng)物模型。用2.5%戊巴比妥鈉按60 mg/kg腹腔麻醉大鼠。從中線打開腹膜，暴露腹主動(dòng)脈，A組不對(duì)主動(dòng)脈進(jìn)行夾閉，其他兩組用50 g動(dòng)脈夾在右腎動(dòng)脈上方阻斷主動(dòng)脈，使脊髓缺血60 min，取出夾子，關(guān)閉腹部切口。B組動(dòng)脈夾閉后腹腔注射0.9%生理鹽水0.1 ml，C組動(dòng)脈夾閉后腹腔注射50 mg/kg的NAD+。

1.3 神經(jīng)功能評(píng)估脊髓損傷后大鼠的后肢神經(jīng)功能采用大鼠脊髓損傷(BBB)評(píng)分[8]進(jìn)行評(píng)估，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富但不清楚本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的評(píng)估人員，在脊髓損傷術(shù)前及術(shù)后3、6、12、24、48 h進(jìn)行評(píng)估并記錄，將每只大鼠單獨(dú)放在開闊的地方觀察活動(dòng)5 min，記錄從0分(完全癱瘓)到21分(正常運(yùn)動(dòng))的BBB評(píng)分。

1.4 固定、切片和染色術(shù)后48 h每組選取4只大鼠，2.5%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔麻醉，通過心臟對(duì)大鼠灌注200 ml生理鹽水(35 ml/min)，然后灌注4%多聚甲醛300 ml(25 ml/min)。收集脊髓組織固定于4%多聚甲醛中24 h。切取胸腰段脊髓區(qū)域組織1 cm，采用不同濃度的乙醇脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋。切取脊髓橫截面，5 μm厚，每0.5 mm選取一片于載玻片上，每個(gè)脊髓組織切取20片，二甲苯脫蠟處理， 100%和95%乙醇水化，尼氏染色。切片浸入56 ℃甲苯胺藍(lán)染液中30 min，酒精階梯分色，二甲苯透明處理，樹脂封片。

1.5 氧化應(yīng)激及抗氧化能力檢測(cè)術(shù)后48 h每組選取4只大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉(120 mg/kg)，以脊髓損傷處(T13～L1)為中心切取新鮮脊髓組織約1.5 cm，取一半用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，另一半留作用于蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。加入10倍脊髓重量的預(yù)冷PBS，用勻漿器轉(zhuǎn)化為100 g/L的脊髓勻漿。4 ℃下對(duì)勻漿進(jìn)行離心(3 500 r/min)15 min。根據(jù)試劑盒說明書測(cè)量脊髓組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性與丙二醛(MDA)含量。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡取“1.5”項(xiàng)中獲得的一半新鮮脊髓組織，用包含2 mg蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀法(RIPA)緩沖液進(jìn)行勻漿。4 ℃下以12 000g離心力離心30 min，取出上清液，100 ℃加熱10 min，用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后分別孵育Cleaved Caspase-3、Gapdh的一抗和相應(yīng)二抗，在LAS 4000顯色系統(tǒng)中進(jìn)行顯影并拍照，Image J 1.46軟件分析顯影的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 3組神經(jīng)功能比較見圖1。BBB評(píng)分3組術(shù)前均為21分；術(shù)后3、6、12、24和48 h A組均為21分；B組依次為3～6(4.5±1.3)分、6～8(6.8±1.0)分、8～10(8.7±1.0)分、9～11(9.8±0.9)分和9～11(10.3±1.0)分；C組依次為7～9(8.3±0.9)分、9～11(10.5±1.0)分、10～13(11.5±1.3)分、11～15(12.8±1.7)分和11～13(12.3±1.1)分。術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分B組和C組均低于A組(P<0.05)，C組均高于B組(P<0.05)。

2.2 3組尼氏染色結(jié)果比較見圖2。一側(cè)脊髓前角正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目：A組7～11(8.8±1.7)個(gè)，B組 1～2 (1.3±0.5)個(gè)，C組 4～9個(gè) (6.7±2.2)個(gè)，A組明顯多于B組和C組(P<0.05)，C組明顯多于B組(P<0.05)。

圖1 手術(shù)前后3組BBB評(píng)分比較

圖2 3組尼氏染色結(jié)果 A.A組神經(jīng)元形態(tài)正常，胞質(zhì)清晰，胞核均勻；B.B組脊髓前角的完整運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元明顯喪失，可見核萎縮和前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞消失；C.C組脊髓前角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元得到了明顯的保留

2.3 3組氧化應(yīng)激和抗氧化能力的比較① 術(shù)后48 h SOD活性：A組為261.3～284.6(276.3±11.5)U/mg prot，B組為178.6～222.8(199.4±21.3)U/mg prot，C組為211.3～264.3(240.1±23.2)U/mg prot，B組和C組均低于A組(P<0.05)，B組低于C組(P<0.05)，見圖3。 ② 術(shù)后48 h MDA含量：A組為5.5～6.8(6.2±0.5)nmol/mg prot，B組為12.1～15.4(13.3±1.5)nmol/mg prot，C組為8.3～11.5(9.9±1.3)nmol/mg prot，B組和C組均高于A組(P<0.05)，B組高于C組(P<0.05)，見圖4。

2.4 3組蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果比較見圖5。術(shù)后48 h Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平：A組為0.26～0.35(0.30±0.05)，B組為0.82～1.00(0.91±0.09)，C組為0.55～0.68(0.60±0.07)。B組和C組均高于A組(P<0.05)，B組高于C組(P<0.05)。

圖3 3組術(shù)后48 h SOD活性比較 與A組比較：*P<0.05；與B組比較：#P<0.05

3 討論

SCII是脊柱外科和血管外科較嚴(yán)重的并發(fā)癥，盡管手術(shù)技術(shù)的提高減少了其發(fā)生，但近20%的高危患者仍會(huì)發(fā)生SCII[2]。盡管導(dǎo)致SCII的細(xì)胞和分子機(jī)制尚未清楚解釋，但研究[1]表明，氧化應(yīng)激在缺血發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，可能是缺血再灌注損傷的治療靶點(diǎn)。因此，針對(duì)SCII后的氧化應(yīng)激可能為神經(jīng)保護(hù)提供一種理想的治療方法。

NAD+是機(jī)體能量代謝的關(guān)鍵輔因子，也是多種酶的底物。研究[9]表明，NAD+可降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡，改善腦缺血損傷。然而，關(guān)于NAD+對(duì)SCII是否有保護(hù)作用的研究還比較少。中樞神經(jīng)系統(tǒng)含有大量的脂質(zhì)，研究[10]提示脂質(zhì)參與了脊髓損傷主要的病理生理變化，如自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和繼發(fā)性神經(jīng)元損傷。MDA來源于多不飽和脂肪酸的分解，是確定過氧化反應(yīng)程度的關(guān)鍵和可靠指標(biāo)[11]。SOD催化超氧化物陰離子歧化為過氧化氫和分子氧，是對(duì)抗活性氧代謝產(chǎn)物的主要防御手段[12]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后48 h MAD含量B組和C組均高于A組(P<0.05)，B組高于C組(P<0.05)；SOD活性B組和C組均低于A組(P<0.05)，B組低于C組(P<0.05)。這表明NAD+有利于改善SCII后的氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一種強(qiáng)介質(zhì)，氧化應(yīng)激引起的線粒體功能障礙可能導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放和Cleaved Caspase-3的激活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。Cleaved Caspase-3是一種經(jīng)常被激活的死亡蛋白酶，是程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵介質(zhì)，催化許多關(guān)鍵細(xì)胞蛋白的特異性分裂。研究[14]提示，NAD+ 的補(bǔ)充可以防止細(xì)胞的死亡，并且NAD+的補(bǔ)充被認(rèn)為是一種減少神經(jīng)元缺血損傷的有效方法[15]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后48 h Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)水平B組高于C組(P<0.05)，我們認(rèn)為NAD+可能減少了SCII后的氧化應(yīng)激并抑制線粒體Cleaved Caspase-3介導(dǎo)的凋亡，通過減少神經(jīng)元凋亡來改善功能。另外，本研究結(jié)果顯示，脊髓前角的正常形態(tài)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目C組明顯多于B組(P<0.05)，術(shù)后各時(shí)間段BBB評(píng)分C組高于B組(P<0.05)，提示NAD+ 改善SCII大鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能可能是通過減少脊髓前角的正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

圖4 3組術(shù)后48 h MDA含量比較 與A組比較：*P<0.05；與B組比較：#P<0.05

圖5 3組術(shù)后48 h Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)水平比較 A.3組Cleaved Caspase-3的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果；B.3組Cleaved Caspase-3蛋白質(zhì)免疫印跡的灰度值 與A組比較：*P<0.05；與B組比較：#P<0.05

綜上所述，NAD+ 能夠通過減弱SCII后的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡，從而改善SCII大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。