姜黃素抑制自噬對骨肉瘤耐藥細胞增殖、凋亡的影響

陳祖旺，林 晶,陳雅君,黃志鵬,王 斌

骨肉瘤是青少年較常見的原發于骨間充質的惡性腫瘤，化療是其主要治療方法，可以使患者的保肢率>68%[1]，但原發或者繼發的腫瘤多藥耐藥常阻礙化療藥物療效的發揮，且機制復雜多樣[2]，近期的研究[3]顯示，自噬在腫瘤多藥耐藥中起關鍵的調節作用。姜黃素是一種從姜科植物姜黃根莖中提取得到的酚性色素，可以通過多種通路調控腫瘤細胞增殖、遷移和凋亡[4]，甚至在一些腫瘤多藥耐藥細胞中也能發揮抗腫瘤活性，是一種具有良好開發前景的抗腫瘤藥物[5]。本研究觀察姜黃素抑制自噬對骨肉瘤耐藥細胞增殖、凋亡的影響，旨在為腫瘤多藥耐藥骨肉瘤患者尋找新的潛在治療藥物。

1 材料與方法

1.1 細胞來源、試劑和儀器人骨肉瘤MG-63 細胞購自中國科學院上海細胞庫。姜黃素、四甲基偶氮噻唑藍(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亞砜購自Sigma-Aldrich公司；DMEM培養基、胎牛血清(FBS)購于Gibco公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；微管相關蛋白Ⅰ/Ⅱ輕鏈3(LC3Ⅰ/Ⅱ)抗體、內參GAPDH抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標記二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。細胞培養箱購自SANYO公司；Elx800全波長酶標儀購自Bio Tek公司；Quanta SC流式細胞儀購自貝克曼庫爾特公司。

1.2 順鉑耐藥細胞的構建采用藥物濃度遞增誘導法[6]構建MG-63順鉑耐藥細胞株(MG-63/DDP)，步驟如下：取對數生長期MG-63細胞接種于6孔板，每孔105個細胞，培養于10% FBS、100 U/ml 青霉素和100 g/L鏈霉素的DMEM培養液中，細胞貼壁后，更換含0.5 μmol/L順鉑培養液，約1個月細胞生長穩定后，增加順鉑濃度為1 μmol/L，依次逐漸增加到2 μmol/L，直到MG-63細胞可以在2 μmol/L順鉑環境中穩定生長和傳代4～6個月，此細胞為MG-63/DDP細胞。

1.3 MTT法檢測細胞增殖抑制率取對數生長期MG-63細胞和MG-63/DDP細胞，接種到96孔板，每孔103個細胞，過夜細胞貼壁后，加入0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L對倍稀釋的順鉑，繼續培養48 h，每孔加入0.5 g/L MTT，繼續孵育培養4 h，吸去上清液，每孔加入100 μl二甲基亞砜溶解結晶，酶標儀570 nm 波長處檢測每孔光密度值，計算順鉑對MG-63細胞和 MG-63/DDP細胞的半數抑制濃度(IC50值)。實驗數據錄入Excel軟件，采用Bliss法計算IC50。

1.4 實驗分組及細胞凋亡檢測實驗分為A、B、C、D 4組：① A組——將MG-63細胞接種到6孔板，每孔105個細胞，細胞貼壁后加入10 μmol/L順鉑；② B組——將MG-63/DDP細胞接種到6孔板，每孔105個細胞，細胞貼壁后加入10 μmol/L順鉑；③ C組——將MG-63/DDP細胞接種到6孔板，每孔105個細胞，細胞貼壁后加入2 μmol/L姜黃素；④ D組——將MG-63/DDP細胞接種到6孔板，每孔105個細胞，細胞貼壁后加入2 μmol/L姜黃素+10 μmol/L順鉑。培養48 h后，4組均用胰酶消化細胞，PBS洗滌2次，使用凋亡檢測試劑盒檢測各組細胞凋亡率的變化。膜聯蛋白V(Annexin V+)以及Annexin V+碘化丙啶(PI+)細胞均為凋亡細胞，使用流式細胞儀檢測凋亡細胞占比。

1.5 Western blot檢測蛋白表達4組細胞培養48 h后，胰酶消化細胞，PBS洗滌細胞2次，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，100 ℃水浴20 min，每個樣品取10 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉移到陽離子尼龍膜，孵育LC3Ⅰ、LC3Ⅱ或GAPDH一抗，過夜，4 ℃孵育二抗1 h，X線下曝光，AI600 Images軟件檢測目的條帶，以內參為對照計算LC3Ⅱ蛋白相對表達量與LC3Ⅰ蛋白相對表達量的比值(LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ)。

2 結果

2.1 順鉑對MG-63細胞和MG-63/DDP細胞增殖抑制的影響見圖1。順鉑對MG-63細胞和MG-63/DDP細胞的IC50值分別為4.04～7.62(5.14±1.02)、10.63～14.25(12.42±1.52) μmol/L，兩者比較差異有統計學意義(t=12.315，P<0.01)。

圖1 順鉑對MG-63細胞和MG-63/DDP細胞增殖抑制的影響

2.2 姜黃素促進順鉑誘導MG-63/DDP細胞凋亡的檢測見圖2。細胞凋亡率A～D組分別為25.54%～36.48%(30.26%±4.15%)、9.26%～13.33%(11.32%±1.64%)、0.82%～2.53%(1.37%±0.34%)和19.24%～27.06%(22.72%±3.36%)，各組整體比較差異有統計學意義(F=6.814，P<0.01)；細胞凋亡率D組明顯高于B組(t=11.312，P<0.01)。

圖2 姜黃素促進順鉑誘導MG-63/DDP細胞凋亡的檢測

2.3 姜黃素對MG-63/DDP細胞自噬的抑制作用見圖3、4。LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值A～D組分別為0.27～0.45(0.36±0.07)、2.44～4.53(3.54±0.72)、0.52～1.62(1.13±0.46)和0.77～1.91(1.32±0.52)，各組整體比較差異有統計學意義(F=3.216，P<0.05)；LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值B、C、D組均明顯高于A組(P<0.01)，且B組明顯高于C、D組(P<0.01)。

圖3 LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白的Western blot檢測

圖4 4組LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值分析 與A組比較：**P<0.01；與B組比較：▲▲P<0.01

3 討論

骨肉瘤化療方案多含有鉑類藥物，其耐藥機制復雜[7]，自噬是細胞程序性死亡的途徑之一，近期研究[8]顯示，自噬可以參與腫瘤耐藥的調控，長期使用順鉑可以誘導自噬，激活絲裂原活化蛋白激酶參與骨肉瘤細胞耐藥[9]，而且抑制骨肉瘤細胞自噬可以逆轉腫瘤耐藥[10]。本研究使用藥物濃度遞增誘導法構建MG-63/DDP細胞株，結果顯示順鉑對MG-63/DDP細胞的IC50值顯著高于MG-63細胞，說明誘導耐藥的產生，MG-63/DDP細胞可以用于后續實驗。LC3Ⅰ和LC3Ⅱ是自噬的標志性蛋白，自噬增強時LC3-Ⅰ可由蛋白酶Atg4切割經修飾形成PE結合型LC3-Ⅱ，使用LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值可以反映出細胞自噬的激活狀態[11]。本研究中的自噬蛋白Western blot分析顯示，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值B、C、D組均顯著高于A組，說明了MG-63/DDP細胞處于自噬激活狀態。

姜黃素是從姜科植物姜黃的根莖中提取的一種酚性天然色素，研究[12]顯示，姜黃素可以抑制骨肉瘤細胞增殖、促進細胞凋亡，在胃癌的研究[13]中發現，姜黃素可以調節胃癌AGS細胞的自噬通路發揮抗腫瘤效果，而且在一些耐藥腫瘤細胞中也可以發現姜黃素對自噬通路的調節作用[14]。本研究中， LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ值C、 D組顯著低于B組，說明姜黃素可以抑制MG-63/DDP細胞自噬通路的激活；細胞凋亡分析顯示，細胞凋亡率D組顯著高于B組，提示抑制了MG-63/DDP細胞自噬激活后，順鉑對MG-63/DDP細胞的致凋亡作用顯著增加，上述結果預示姜黃素可以克服骨肉瘤細胞的多藥耐藥。本研究中， 細胞凋亡率C組只有0.82%～2.53%(1.37%±0.34%)，說明本實驗劑量的姜黃素對細胞生長無顯著影響，文獻[15]顯示，姜黃素是一種高效低毒的抗腫瘤藥物，對人體幾乎沒有副作用，是一個有前景的抗腫瘤臨床開發候選藥物。

綜上所述，姜黃素可以抑制MG-63/DDP細胞自噬激活，促進順鉑誘導的骨肉瘤細胞多藥耐藥細胞凋亡。